Warianty utraty funkcji w śródbłonkowej lipazie są przyczyną podwyższonego cholesterolu HDL u ludzi ad 8

Supernatant podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze około 80 ° C. Analiza białek. Białka w próbkach kondycjonowanej pożywki z transfekowanych komórek rozdzielano na żelach NuPAGE 10% Bis-Tris (Invitrogen) i żele przenoszono na membrany PVDF. Filtry PVDF sondowano przy użyciu rozcieńczenia 1: 1000 króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-ludzkiego EL i rozcieńczenia 1: 5 000 skoniugowanego z HRP przeciwciała anty-króliczego IgG i wizualizowano stosując odczynniki ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare). Testy lipazy. Testy fosfolipazy, z użyciem stabilizowanego glicerolem substratu dipalmitoilofosfatydylocholiny, przeprowadzono w sposób opisany powyżej (12) w trzech powtórzeniach. Każdą transfekcję powtarzano co najmniej 3 oddzielne razy. HDL3 wyizolowano za pomocą ultrawirowania z gradientem gęstości bromku potasu (53) z połączonego ludzkiego osocza, a testy hydrolizy lipidów lipoprotein za pomocą rekombinowanych lipaz przeprowadzono jak opisano uprzednio (33) w trzech powtórzeniach. Wolne kwasy tłuszczowe wytwarzane przez hydrolizę lipoprotein mierzono w trzech powtórzeniach stosując zestaw NEFA C (Waco Pure Chemical Industries) zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie dane aktywności zostały znormalizowane do procentowej zawartości lipazy WT. Konstrukcja wektorowa AAV. Plazmidy cis pAAV.TBG.EL.WT i pAAV.TBG.EL.Asn396Ser wytworzono przez klonowanie regionu kodującego z plazmidu ekspresyjnego EL opisanego powyżej do cis-plazmidu pAAV.TBG (54). Wirusy AAV2 / 8-EL.WT i AAV2 / 8-EL.Asn396Ser wytworzono przez potrójną transfekcję do komórek 293, z adenowirusowym plazmidem pomocniczym i chimerycznym konstruktem do pakowania, w którym gen rep AAV2 jest połączony z genem czapeczki serotypu. 8. Kontrolny gen LacZ zapakowano do AAV, również o serotypie 2/8. Kopię genomu określono za pomocą analizy TaqMan (Applied Biosystems). Zwierząt. Mężczyzna w wieku od 8 do 10 tygodni Lipg. /. myszy na tle C57BL / 6 (14) podawano AAV w kopiach genomu 3 × 1010 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez wstrzyknięcie ip. Próbki krwi zbierano następnie w kilku punktach czasowych w znieczuleniu izofluranem (Vedeco Inc.). Komitet IACUC Uniwersytetu Pensylwanii zatwierdził ten protokół. Analiza plazmowa. Próbki krwi pobrano z nakłucia splotu żylnego za pomocą heparynizowanych kapilar (Fisher Scientific). Osocze oddzielono przez odwirowanie przy 7000 g przez 10 minut. HDL-C mierzono enzymatycznie w autoanalizatorze Cobas Fara II (Roche Diagnostic Systems Inc.) stosując odczynniki Wako Chemicals. Statystyka. Funkcjonalne przewidywanie niesynonimowych wariantów przeprowadzono przy użyciu PolyPhen (30), a wyrównanie białek wytworzono przy użyciu ClustalW (31). Liczby wariantów zidentyfikowanych w każdej grupie sekwencjonującej porównywano za pomocą dokładnego testu Fishera. Wartości triglicerydów zostały przekształcone w log. Wszystkie analizy genetyczne przyjęły addytywny model dziedziczenia. Analizowano FHS, stosując wielozmienną liniową regresję reszt fenotypów lipidowych, oddzielnie według płci, po dostosowaniu do wieku, wieku 2, BMI, spożycia alkoholu i palenia. Dodatkowo, u kobiet, proporcje egzaminów, że kobieta była w okresie menopauzy i hormonalna terapia zastępcza zostały włączone jako współzmienne. NHS II / HPFS analizowano stosując wielozmienną liniową regresję HDL-C (mg / dl), skorygowaną o wiek, wiek2, alkohol, palenie tytoniu, BMI, porcję laboratoryjną i podetap. PennCATH analizowano przy użyciu wielozmiennej regresji liniowej HDL-C (mg / dl), po dostosowaniu do grupy stwierdzającej, wieku, płci, BMI i stanu palenia. W przypadku kohort kontrolnych, częstości genotypów w poszczególnych populacjach analizowano stosując uogólniony model liniowy z dostosowaniem do wieku, wieku2, płci, BMI i stanu palenia. Kohorta Penn HDL CC obejmowała również dostosowanie do spożycia alkoholu. Każde badanie przeanalizowano osobno, a w celu podsumowania danych przeprowadziliśmy metaanalizę zaimplementowaną w oprogramowaniu METAL (28). Ponieważ każde badanie było analizowane nieco inaczej, zdecydowaliśmy się użyć ważonej metaanalizy z-statystyką, która wykorzystuje wartość P i kierunek efektu do obliczenia statystyki z. Indywidualną z-statystykę połączono i obliczono całkowitą statystykę Z jako ważoną sumę każdej indywidualnej statystyki z, gdzie wagi były proporcjonalne do pierwiastka kwadratowego liczby osobników badanych w każdej próbce i zostały wybrane tak, że kwadraty wag sumy do 1. Odpowiednia wartość P została następnie obliczona. QTDT (55, 56) wykorzystano do testowania powiązania wariantów LIPG z poziomami HDL-C w rozszerzonych rodowodach
[patrz też: testy z pierwszej pomocy, pizza hawajska składniki, czy pasujemy do siebie test ]
[więcej w: prawo wykonywania zawodu lekarza, polskie towarzystwo medycyny estetycznej, ursus 11054 ]