Warianty utraty funkcji w śródbłonkowej lipazie są przyczyną podwyższonego cholesterolu HDL u ludzi ad 7

Obecna terapia była, w miarę możliwości, przerwana, a podczas drugiej wizyty około 6 tygodni później, ponownie ustalono wartości biochemiczne i biometryczne w celu dostarczenia danych w diecie / nieobecności terapii lekowej. Ta druga wartość lipidowa jest używana w naszej analizie. Przypadki były mieszane europejskie pochodzenia z HDL-C na lub powyżej 95. percentyla dla wieku i płci z obu badań (kobiety, zakres 75. 186 mg / dl, mężczyźni, zakres 68. 131 mg / dl). Kontrole były uczestnikami mieszanego europejskiego pochodzenia z HDL-C poniżej lub 25 percentyla, z wyłączeniem osób z HDL-C poniżej 20 mg / dl w celu wyeliminowania uczestników z prawdopodobnymi monogenicznymi zaburzeniami metabolizmu lipoprotein, prowadząc do obniżonego stężenia HDL-C (kobiety, zakres 20. 49 mg / dl; mężczyźni, zakres 22. 42 mg / dl). Uczestnicy badania dla kohorty podstawowej społeczności. FHS (n = 5 126 uczestników) zatrudniono w 1971; uczestnicy byli badani mniej więcej co 4 do 8 lat. Badaliśmy genotypy w panelu 809 niespokrewnionych osób, które dostarczyły próbki krwi do ekstrakcji DNA podczas szóstego cyklu badania (1995. 1998). Pomiary HDL były dostępne w maksymalnie 7 punktach czasowych dla każdej osoby. Użyliśmy średniej HDL z dostępnych miar dla każdej osoby. HDL2, HDL3, rozmiar HDL, podfrakcje HDL i apoA-I, zmierzone na egzaminie 4, zostały określone jak opisano wcześniej (46. 48). Instytucjonalna Komisja Rewizyjna w Boston Medical Center zatwierdziła badanie, a wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę. Uczestnicy badania dla kohort replikacji. Nasze kohorty kontrolujące przypadki (Penn HDL CC i UKE Hamburg CC) obejmowały przypadki zaczerpnięte z HHDL (n = 602), kontrole pochodzące z badania przeprowadzonego przez University of Pennsylvania z badania Inherited Risk of Coronary Atherosclerosis (SIRCA) (n = 437), oraz przypadki i kontrole z poradni lipidowej, UKE Hamburg CC (n = 420, 199 przypadków, 221 kontroli), odpowiednio. Kohorty HHDL i UKE Hamburg CC zostały opisane powyżej. SIRCA jest przekrojowym badaniem czynników związanych z zwapnieniem tętnic wieńcowych u bezobjawowych uczestników rekrutowanych na podstawie wywiadu rodzinnego przedwczesnego CAD. Projekt badania i wstępne ustalenia zostały już opublikowane (49). Nasze populacyjne kohortacje replikacyjne obejmowały podgrupę osób z NHS II / HPFS (n = 1,808), które zostały wcześniej zgłoszone (50, 51) i PennCATH (n = 1,598). PennCATH składa się z kolejnych uczestników poddanych koronarografii w szpitalach University of Pennsylvania Health System i został wcześniej opisany (52). Sekwencjonowanie, wariantowe odkrywanie i genotypowanie. Ekstrakty LIPG i połączenia egzon-intron sekwencjonowano, jak opisano wcześniej (16). Wszystkie zidentyfikowane warianty zostały potwierdzone przez ponowne sekwencjonowanie, testy genotypowania Taqman (Applied Biosystems) lub analizę RFLP. Genotypowanie w HHDL, SIRCA, FHS i NHS II / HPFS przeprowadzono za pomocą testów genotypowych Taqman. Genotypowanie w PennCATH przeprowadzono przy użyciu tablicy Candidate Gene Illumina IBC, wersja (40). Genotypowanie w kohorcie UKE Hamburg CC przeprowadzono według RFLP, jak opisano wcześniej (16). Przygotowanie plazmidów do analizy in vitro. CDNA dla ludzkiego EL (NM006033) wstawiono do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3 (Invitrogen). Mutagenezę plazmidu ekspresyjnego EL w celu wprowadzenia każdego z niesynonimicznych wariantów przeprowadzono stosując zestaw do mutagenezy ukierunkowanej miejscowo (Stratagene) QuikChange z wcześniej opisanymi warunkami reakcji łańcuchowej polimerazy (32). W celu wytworzenia plazmidu ekspresyjnego wariantu X501Arg, cDNA dla ludzkiego EL (BC060825) zmieniono przez ukierunkowaną mutagenezę i wydłużony region kodujący wstawiono do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3. Plazmidy sekwencjonowano po ukierunkowanej mutagenezie, aby potwierdzić zmianę i wykluczyć dodatkowe niespecyficzne zmiany. Hodowlę komórkową. Komórki HEK293 hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS i 1% antybiotyku / antymycotic. W celu oznaczenia aktywności lipazy, komórki hodowano do 90% konfluencji (na płytkach 100-mm), a 5,85 .g EL wyrażających plazmid transfekowano stosując Lipofectamine (Invitrogen), zgodnie z instrukcjami producenta. W 24 godziny po transfekcji, pożywki usunięto i zastąpiono pożywką bez surowicy zawierającą 10 U / ml heparyny. Aby promować dysocjację lipazy z komórek, w 47,5 godziny po transfekcji, do każdej pożywki dodawano dodatkowe 10 U / ml heparyny. Po 48 godzinach po transfekcji zebrano pożywki i odwirowano przy 100 g przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórkowych.
[przypisy: ursus 8014, olej kokosowy organiczny, rozdrabniacz uniwersalny ]
[przypisy: szpital na szaserów warszawa, czy pasujemy do siebie test, okulistyka ceglana katowice ]