Sygnalizacja poprzez CD28 i CTLA-4 kontroluje dwie różne formy anergii komórek T czesc 4

Alternatywnie kostymulacja zależna od B7 została zablokowana podczas podstawowej aktywacji przez dodanie CTLA4Ig (15 .g / ml). Po 4 dniach kultury przemywano, wysiewano na świeżą pożywkę i odpoczywano przez dodatkowe 48 godzin. Komórki T ponownie stymulowano przez 5 godzin przez dodanie kulek polistyrenowych (5 .m) pokrytych przeciwciałami anty-CD3 (5 .g / ml) i anty-CD28 (5 .g / ml) i częstotliwością komórek CD4 +. wytwarzanie IL-2 oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Wykresy pokazują wytwarzanie IL-2 w funkcji podziału komórki (fluorescencja CFSE) w podzbiorze komórek T CD4 +. Pionowe linie wyznaczają podzielone z niepodzielonych komórek, a poziome linie oznaczają maksymalną fluorescencję komórek barwionych przeciwciałem kontrolującym izotyp. Wartości w każdym rogu reprezentują proporcję zdarzeń CD4 +, które mieszczą się w każdym kwadrancie. Komórki hodowane w pożywce bez bodźca i barwione specyficznym przeciwciałem były mniej niż 0,1% dodatnie dla IL-2. Dane te są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. Częstotliwość wytwarzania IL-2 wśród komórek T CD3 / CD28 stymulowanych była różna w różnych eksperymentach (zakres: <10 ~ 35%); jednak częstotliwość producentów IL-2 w hodowlach zagnieżdżonych w obecności CTLA4Ig była konsekwentnie zmniejszana dwu- do czterokrotnie. Wyniki te sugerują nam możliwość, że rzadka populacja komórek T CD4 +, które odniosą sukces w dzieleniu się po aktywacji przy braku kostymulacji za pośrednictwem B7, może uniknąć indukcji anergii. Masowe testy indukcji anergii, takie jak inkorporacja [3H] tymidyny, które łącznie mierzą odpowiedź proliferacyjną wszystkich komórek T, nie byłyby w stanie wykryć odpowiedzi proliferacyjnej kilku podzielonych komórek T CD4 +. Aby przezwyciężyć ten problem, komórki T CD4 + znakowane CFSE, które zostały zagruntowane i wypoczęte jak na Figurze 1, posortowano na frakcje reprezentujące komórki, które albo osiągnęły dwie podziały komórkowe, albo które pozostały niepodzielone przez cały okres hodowli (Figura 2, a. n). Te oczyszczone komórki następnie ponownie stymulowano przez dodanie rozpuszczalnego przeciwciała anty-CD3 w obecności syngenicznych napromieniowanych splenocytów i proliferację oceniano na poziomie pojedynczej komórki 96 godzin później przez intensywność CFSE. Jak pokazano na Fig. 2, a n, byliśmy w stanie uzyskać jednorodne populacje podzielonych i niepodzielonych komórek przez sortowanie komórek. Co więcej, był to stabilny fenotyp, ponieważ poziom barwienia CFSE był niezmieniony przez ciągłą hodowlę w samej pożywce, co wskazuje, że komórki przestały się namnażać podczas okresu odpoczynku (Figura 2, b, c, i i j). Figura 2B7, w której pośredniczy kostymulacja i podział komórek, reguluje różnie proliferację wtórnych limfocytów T. (a. o) śledziona komórka śledziona i węzeł limfatyczny stymulowana CFSE była stymulowana anty-CD3 w obecności ludzkiej IgG (a | g, pierwszy i drugi zestaw kolumn w o) lub CTLA4Ig (h. n, trzeci i czwarty zestaw kolumn w o). Kultury odpoczywano przez 48 godzin, a komórki Thy1.2 +, które dzieliły się dwa razy (b, d, f, i, k i m, zacienione słupki w o) lub pozostawały niepodzielone (c, e, g, j, l i n; otwarte słupki w o) po pierwotnej stymulacji zostały oczyszczone przez FACS. Posortowane komórki T hodowano z napromienionymi APC i ponownie stymulowano anty-CD3 w obecności lub pod nieobecność egzogennej IL-2; proliferację oceniano 4 dni później za pomocą cytometrii przepływowej. Jeden reprezentatywny eksperyment dla każdego warunku (a. G i h. N) przedstawiono graficznie. Średnie wtórne zdarzenia mitotyczne z oddzielnych eksperymentów (n = 2 [pierwszy i drugi zestaw kolumn] lub n = 4 [trzeci i czwarty zestaw kolumn]) wykreślono w o. Statystycznie istotne różnice oceniano za pomocą sparowanego t testu i oznaczono je nawiasami: * P <0,05; *** P <0,001. (p) Komórki limfatyczne i śledziony hodowano z anty-CD3 w połączeniu z przeciwciałem anty-CD28 (pierwsza i druga ścieżka) lub CTLA4Ig (trzecia i czwarta ścieżka). Hodowle odpoczywano przez 24 godziny, a limfocyty T ponownie stymulowano kulkami opłaszczonymi anty-CD3a przez 48 godzin w obecności (druga i czwarta ścieżka) lub nieobecności (pierwsza i trzecia ścieżka) IL-2. Żywe komórki zebrano po głównym bodźcu (górne panele) i po wtórnym bodźcu (dolny panel) przez izolację na Ficoll, a lizaty poddano analizie immunoblot przy użyciu przeciwciał przeciw p27kip1 (górny i dolny panel) lub aktynie (dane nie pokazane) . Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. (q) Pierwotne limfocyty T znakowane CFSE były stymulowane anty-CD3 jak w p i wypoczęte (górny panel), a część komórek była ponownie stymulowana 50 j / ml IL-2 przez 48 godzin (środkowy panel) lub PMA / jonomycyna (PMA / Iono) przez 24 godziny (dolny panel) [podobne: testy z pierwszej pomocy, polipektomia endoskopowa, szpital na szaserów warszawa ] [patrz też: olej kokosowy organiczny, polipektomia endoskopowa, tomografia komputerowa gdynia ]