Sygnalizacja poprzez CD28 i CTLA-4 kontroluje dwie różne formy anergii komórek T cd

Po 4 dniach hodowle przemywano, a komórki były replikowane w świeżej pożywce przez 24 godziny. Ponownie stymulowane komórki następnie ponownie stymulowano przez 48 godzin w 96-dołkowych okrągłodennych płytkach z kuleczkami polistyrenu powleczonymi anty-CD3 (5 ug / ml) w obecności lub nieobecności IL-2 (50 U / ml). Sporządzono lizaty całokomórkowe, poddano SDS-PAGE (3 × 105 do 5 × 105 równoważników komórek na ścieżkę) i przeniesiono na błony nitrocelulozowe. Bloty sondowano mAb przeciwko p27kip1 (rozcieńczenie 1: 1000) i białko immunoreaktywne wizualizowano przez autoradiografię po sondowaniu sprzężonym z peroksydazą drugorzędowym przeciwciałem (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) i inkubacji z odczynnikiem chemiluminescencyjnym (Roche Molecular Biochemicals ). Plamki były usuwane i reprobowane króliczą surowicą przeciwko aktynie (1: 1000), aby kontrolować ładowanie. Wyniki Komórki T CD4 +, które proliferują w nieobecności kostymulacji CD28, nie uciekają przed klęską anergią. Cząsteczka kostymulująca CD28 odgrywa wyraźną rolę w rozwoju komórek T efektora / pamięci (5) oraz w unikaniu klonalnej anergii (15). Jednak wcześniejsze badania sugerują również, że zarówno unikanie anergii (4, 16, 18), jak i funkcja efektorowa (3, 22, 23) w aktywowanych populacjach komórek T CD4 + są ściśle związane z podziałem komórek. Pozostaje niejasne, czy wpływ CD28 lub CTLA-4 na generowanie puli efektorowej / pamięci jest bezpośrednią konsekwencją transdukcji sygnału przez te koreceptory lub pośredniego, w której pośredniczy regulacja proliferacji komórek T. Aby rozróżnić te dwie możliwości, modulowaliśmy sygnały kostymulatorowe za pośrednictwem B7 podczas primingu komórek T i ocenialiśmy zdolność uzyskanych komórek T CD4 + do wytwarzania IL-2 po ponownym ligowaniu TCR w zależności od ich pierwotnego zachowania proliferacyjnego. W tym modelu, komórki śledziony i węzłów chłonnych luzem znakowano CFSE i stymulowano mAb anty-CD3 w obecności albo kontrolnego mAb albo CTLA4Ig. W tym układzie komórki prezentujące antygen (APC) obecne w preparacie komórek jednojądrzastych zapewniają endogenną kostymulację B7 komórkom T, która jest blokowana przez CTLA4Ig. Po 4 dniach komórki przemywano i umieszczano w świeżej pożywce na 48 godzin. Na koniec limfocyty T ponownie stymulowano przez 5 godzin za pomocą kulek powleczonych anty-CD3 i anty-CD28, a wytwarzanie IL-2 w bramkowanym podzestawie CD4 + oceniano przez barwienie wewnątrzkomórkowe i analizę cytometrii przepływowej. Ponieważ dalszy podział komórek nie występuje podczas tego krótkiego okresu ponownej stymulacji, profil CFSE komórek w tym czasie jest reprezentatywny dla podziału komórki podczas odpowiedzi pierwotnej (dane 3 niepokazane). W eksperymencie pokazanym na rycinie potwierdzamy wcześniejsze obserwacje przeprowadzone przez nasze laboratorium i innych, że odpowiedź proliferacyjna limfocytów T w tych warunkach jest heterogenna. Nawet przy kostymulacji B7 zapewnionej przez APC, do 30% prekursorów T komórek wejściowych nie udało się podzielić (odnośnik 2, Figura 1a), chociaż praktycznie wszystkie komórki (> 97%) otrzymały sygnały aktywujące, jak oceniono przez indukcję ekspresji CD69 w 24 godziny (odniesienie 2, dane nie przedstawione). Blokada kostymulacji przez CTLA4Ig zmniejszała częstotliwość komórek proliferacyjnych (odnośnik 2, Figura 1b). Po odpoczynku i ponownej stymulacji tych uprzednio aktywowanych komórek odkryliśmy, że 48% podzielonej puli komórek T CD4 + zagruntowanych w obecności kostymulacji B7 / CD28 było zdolne do wytwarzania IL-2 po ponownym zaangażowaniu TCR / CD28 (Figura 1a, porównaj górny i dolne lewe kwadranty), podczas gdy tylko 30% niepodzielnej puli komórek T CD4 + było w stanie to zrobić (rysunek 1a, porównaj górny i dolny prawy kwadrant). Dane te potwierdzają obserwowaną wcześniej tendencję między podziałem komórek a produkcją IL-2 na poziomie pojedynczej komórki wśród limfocytów T CD4 + pochodzących z tej samej puli prekursorów (3, 4). Blokada kostymulacji za pośrednictwem B7 podczas pierwotnej stymulacji przy użyciu CTLA4Ig spowodowała znaczące zmniejszenie zarówno podziału komórek, jak i różnicowania efektorów (Figura 1b), ponieważ tylko 15% całkowitych komórek T CD4 + było zdolnych do wytwarzania IL-2 po ponownym zaangażowaniu TCR / CD28 ( w porównaniu z 35% w hodowlach zagruntowanych w fizjologicznych warunkach kostymulacyjnych). Jednak w tych warunkach można również zaobserwować trend związany z podziałem, ponieważ 25,5% rzadkich proliferujących komórek T CD4 + było zdolnych do syntezy IL-2, w porównaniu do częstotliwości jedynie 13,7% w znacznie większej niepodzielnej puli (rysunek 1b). . Ryc. 1. Ocena wytwarzania IL-2 komórek T zarówno przez kostymulację za pośrednictwem B7, jak i podział komórkowy. (a) Połączone komórki limfatyczne BALB / c i śledziony znakowano CFSE, a limfocyty T stymulowano w obecności endogennej mediowanej B7 kostymulacji przez dodanie rozpuszczalnego przeciwciała anty-CD3 (1 .g / ml)
[przypisy: przetrząsarko zgrabiarka, rozdrabniacz uniwersalny, wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy ]
[przypisy: światowe centrum słuchu kajetany, pizza hawajska składniki, wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy ]