Sygnalizacja poprzez CD28 i CTLA-4 kontroluje dwie różne formy anergii komórek T ad

Stosując to podejście, odkrywamy, że dwie różne formy anergii można rozwiązać w populacji komórek T CD4 + stymulowanych in vitro. Jedna forma wynika z ligacji TCR przy braku kostymulacji CD28. Ta forma anergii jest odwracalna przez IL-2, ale nie można jej zapobiec, przechodząc przez cykl komórkowy, co wskazuje, że sam podział komórek nie jest wystarczający do unikania anergii w limfocytach T. Jednak podział komórek wydaje się być konieczny do uniknięcia anergii, ponieważ druga forma anergii wynika z braku proliferacji po aktywacji w warunkach wystarczającej kostymulacji CD28. Ta forma anergii, która jest oporna na IL-2, jest częściowo kontrolowana przez sygnały transdukowane przez negatywny receptor regulatorowy CTLA-4. Wnioskujemy, że unikanie anergii przez podstawowe komórki T jest wieloetapowym procesem. Sygnały za pośrednictwem CD28 i procesy związane z podziałem komórek są wspólnie konieczne i wystarczające, aby zapobiec indukcji odwracalnej anergii IL-2. Co więcej, sugerujemy, że CTLA-4 reguluje anergię na dwa sposoby: pierwszy jest pośredni, poprzez hamowanie progresji cyklu komórkowego, a drugi jest poprzez specyficzny sygnał, który jest wymagany do wywołania niereagującej IL-2 anergii wśród nieproliferujących komórek. Metody Myszy, przeciwciała i odczynniki. Zebrane komórki śledziony i węzłów chłonnych myszy samicy BALB / c, w wieku 8-16 tygodni, zastosowano we wszystkich doświadczeniach. Przeciwciała mAb skierowane przeciw CD3 (145-2C11), CD28 (37,51) i CTLA-4 / CD154 (4F10) oczyszczono z supernatantów hybrydoma. Fragmenty Fab anty-CTLA-4 wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem (10). CTLA4Ig został dostarczony przez R. Peach (Bristol-Meyers-Squibb, Seattle, Washington, USA). Oczyszczone, skoniugowane z fluorochromem mAb przeciwko CD16 / CD32 (blok Fc), Thy1.2, CD4 i IL-2 zakupiono w PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA). mAb swoisty dla p27kip1 zakupiono z Transduction Laboratories (Lexington, Kentucky, USA). Królicze antyserum przeciwko aktynie zakupiono w firmie Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). CFSE (ester sukcynimidylowy dioctanu 5- i 6-karboksyfluoresceiny) i TOPRO-3 zakupiono od firmy Molecular Probes Inc. (Eugene, Oregon, USA). Rekombinowaną mysią IL-2 zakupiono od Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, Massachusetts, USA) i stosowano w stężeniu 10 ~ 50 U / ml. Oznaczanie komórek i warunki hodowli. Izolację komórek i znakowanie fluorescencyjne komórek za pomocą CFSE przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (2). W skrócie, połączone komórki śledziony i węzłów chłonnych inkubowano z CFSE w PBS przy końcowym stężeniu 2. M przez 3 minuty. Komórki znakowane CFSE stymulowano rozpuszczalnym mAb anty-CD3 (1 .g / ml) w stężeniu 2 x 106 do 4 x 106 / ml w 24-studzienkowych płytkach. Gdy wskazano, hodowle zawierały mAb anty-CD28 (1 .g / ml), CTLA4Ig (10 .g / ml), mAb anty-CTLA-4 (10 .g / ml) lub Fabryk anty-CTLA-4 (20. g / ml). W przypadku hodowli pierwotnych komórki stymulowano przez 4 dni, płukano i ponownie dodawano do świeżej pożywki przez 48 godzin, a następnie sortowano na podstawie fluorescencji CFSE. Posortowane limfocyty T ponownie stymulowano w 96-dołkowych okrągłodennych płytkach z napromieniowanymi syngenicznymi splenocytami (czterokrotny nadmiar) i rozpuszczalnym anty-CD3 (1 .g / ml) w obecności lub nieobecności IL-2 (10 U / ml) przez 4 godziny. dni. Wtórną proliferację (fluorescencję CFSE) oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa i sortowanie komórek. Barwienie markerowe na powierzchni komórki i analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono na cytometrze przepływowym FACSCalibur przy użyciu oprogramowania CellQuest (oba, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA). Metody wykorzystujące znakowanie CFSE do obliczenia bezwzględnej liczby zdarzeń mitotycznych występujących w hodowli zostały opisane w innym miejscu (2). Żywy barwnik TOPRO-3 został użyty do rozróżnienia żywych i martwych komórek (2). Żywe komórki Thy1, 2 + lub CD4 + sortowano na podstawie fluorescencji CFSE przy użyciu cytometru przepływowego / sortownika FACSVantage (Becton Dickinson and Co.), jak opisano wcześniej (4). Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin. Wytwarzanie IL-2 oceniano na poziomie pojedynczej komórki, jak opisano wcześniej (21), z pewnymi modyfikacjami. Komórki, które zostały aktywowane w hodowli pierwotnej przez 4 dni i odpoczęte przez 48 godzin hodowano przez 5 godzin z kulkami polistyrenu powleczonymi mAb anty-CD3 i anty-CD28 (5 ug / ml każdy, 5: perełek / T stosunek komórek) w obecności 2. M monenzyny (Sigma Chemical Co.). Jako startery komórek T nie dzielą podczas tego 5-godzinnego okresu ponownej stymulacji (dane nie pokazane), wytwarzanie cytokin można ocenić jako funkcję pierwotnej historii proliferacyjnej bez zastosowania sortowania komórek. Ocena degradacji p27kip1. Połączone komórki śledziony i węzłów chłonnych hodowano w 24-studzienkowych płytkach (4 x 106 komórek / ml) z rozpuszczalnym mAb anty-CD3 (1 .g / ml) i mAb anty-CD28 (1 .g / ml), CTLA4Ig (10 yg / ml) lub mAb anty-CTLA-4 (10 (ig / ml)
[patrz też: pizza hawajska składniki, tomografia komputerowa gdynia, polskie towarzystwo medycyny estetycznej ]
[przypisy: nafta kosmetyczna z olejkiem rycynowym, rehabilitacja po złamaniu szyjki kości udowej, szczecin szpital wojskowy ]