Sygnalizacja poprzez CD28 i CTLA-4 kontroluje dwie różne formy anergii komórek T ad 7

Połączone komórki węzłów chłonnych BALB / c i śledziony znakowano CFSE, a komórki T poddawano ko-sieciowaniu TCR i CD28 przez dodanie perełek polistyrenowych pokrytych anty-CD3 (1 .g / ml), -CD28 (1 .g / ml) i kontrolne chomicze IgG (1 .g / ml). (b) W oddzielnych hodowlach limfocyty T poddano ko-sieciowaniu TCR, CD28 i CTLA-4 przez dodanie perełek polistyrenowych pokrytych anty-CD3 (1 .g / ml), anty-CD28 (1 .g). / ml) i anty-CTLA-4 (1 .g / ml). Proliferację podzbioru komórek T CD4 + oceniano za pomocą cytometrii przepływowej 3 dni później. Częstotliwość prekursorowych komórek T, które dzieliły się w odpowiedzi na bodziec (RF), oraz liczba komórek potomnych T generowanych przez średnią odpowiedź komórek prekursorowych (CP), obliczano jak opisano wcześniej (2, 3). Dane są reprezentatywne dla dwóch oddzielnych eksperymentów. Nieprzewidziane odkrycie eksperymentów opisanych na Fig. 2 polegało na tym, że pula komórek T, która pozostaje niepodzielona po pierwotnej stymulacji TCR w obecności CTLA4Ig była zdolna do odpowiedzi na restymulację anty-CD3 plus IL-2, podczas gdy niepodzielone komórki T powstające z pierwotnego kultury stymulowane bez CTLA4Ig były oporne na ponowną stymulację (Figura 2o, porównaj drugi i czwarty zestaw kolumn). Ponieważ CTLA4Ig w tych hodowlach blokuje ligację zarówno CD28, jak i CTLA-4, znana regulacyjna rola CTLA-4 sugeruje, że rozwój niereaktywności w niepodzielonych komórkach w warunkach stymulacji TCR w obecności ligandów B7 może wynikać z zaangażowania CTLA-4. . Aby przetestować tę możliwość, selektywnie blokowaliśmy interakcje B7a CTLA-4 podczas stymulacji pierwotnej przy użyciu albo całego przeciwciała anty-CTLA-4, albo fragmentów Fab anty CTLA-4. Podczas jawnego usieciowania CTLA-4 nastąpiło zmniejszenie częstości proliferujących komórek T CD4 + (Figura 3), dodanie przeciwciała anty-CTLA-4 lub fragmentów Fab spowodowało 10% wzrost częstości proliferacyjnych komórek T CD4 + w porównaniu z hodowlami, w których dopuszczono fizjologiczne interakcje B7 (3LA-4 (dane nie pokazane). Niemniej jednak, wiele limfocytów T CD4 + (. 25%) wciąż nie ulegało proliferacji w tych warunkach, umożliwiając nam ocenę reaktywności uzyskanych podzielonych w porównaniu z niepodzielonymi limfocytami T CD4 + do ponownej stymulacji anty-CD3 lub IL-2 (Figura 4, a. sol). Figura 4Regulacja wtórnej proliferacji komórek T przez transdukcję sygnału za pośrednictwem CTLA-4f i podział komórki podczas odpowiedzi pierwotnej. (a (3 h) splenocyty znakowane CFSE stymulowano anty-CD3 w obecności chomiczej IgG (pierwszy i drugi zestaw kolumn w h) lub przeciwciało anty-CTLA-4 (10 ug / ml; n = 2 ) lub anty-CTLA-4 Fab (20 .g / ml, n = 2, a-g). Eksperymenty z użyciem całych i Fab fragmentów przeciwciała anty-CTLA-4 dały podobne wyniki i przedstawiono je w połączeniu jako eksperymenty n = 4 (h, trzeci i czwarty zestaw kolumn). Hodowle odpoczywano przez 48 godzin, a komórki Thy1.2 + dzielono dwukrotnie (b, d, i f; zacienione słupki w h) lub pozostawały niepodzielone (c, e, i g; otwarte słupki w h) po pierwotnej stymulacji zostały oczyszczone przez FACS. Posortowane komórki T hodowano z napromienionymi APC i ponownie stymulowano anty-CD3 w obecności lub przy braku egzogennej IL-2, a proliferację oceniano 4 dni później za pomocą cytometrii przepływowej. Jeden reprezentatywny eksperyment przedstawiono graficznie w tab. Średnie wtórne zdarzenia mitotyczne z oddzielnych doświadczeń (n = 4, jak opisano powyżej) wykreślono w h. Dane z kultur kontrolnych (pierwszy i drugi zestaw kolumn w h) są takie same, jak przedstawiono na Figurze 1. Różnice istotne statystycznie oceniono za pomocą sparowanego testu t i oznaczono je nawiasami: * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. (i) Komórki węzła chłonnego i śledziony hodowano z anty-CD3 w połączeniu z anty-CD28 (pierwsza ścieżka) lub anty-CTLA-4 (druga ścieżka). Hodowle następnie odpoczywano przez 24 godziny (pierwszy panel), a część komórek T ponownie stymulowano perełkami powleczonymi anty-CD3 ((drugi panel) przez 48 godzin. W oddzielnym eksperymencie komórki węzłów chłonnych i śledziony pobudzono jak powyżej, wypoczęto (trzeci panel) i stymulowano IL-2 (50 U / ml, czwarty panel) przez 48 godzin. Żywe komórki wyizolowano na Ficoll i lizaty poddano analizie immunoblot przy użyciu przeciwciał przeciw p27kip1 lub aktynie (piąty panel). Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. Podobnie do limfocytów T CD4 +, które nie uległy podziałowi w odpowiedzi na rozpuszczalny anty-CD3 (Figura 2o, pierwszy zestaw kolumn) lub anty-CD3 plus CTLA4Ig (Figura 2o, trzeci zestaw kolumn), niepodzielone komórki T CD4 + pochodzące z hodowli potraktowane przeciwciałem anty-CTLA-4 słabo proliferowały w odpowiedzi na ponowną stymulację anty-CD3 (Figura 4e, Figura 4o, trzeci zestaw kolumn) [przypisy: olej kokosowy organiczny, polskie towarzystwo medycyny estetycznej, ursus 8014 ] [patrz też: ursus 11054, ursus 8014h, przetrząsaczo zgrabiarka ]