Kumulacja miozyny i miopatia mięśni poprzecznie prążkowanych wynikają z utraty palca 1 i 3 mięśnia czesc 4

Stosunek masy ciała do masy ciała wykazywał przerost serca u myszy DKO. (C) Echokardiografia wykazała obniżoną funkcję skurczową LV (frakcyjne skrócenie), zwiększoną średnicę skurczową lewej komory (LVESD) i niezmienioną średnicę końcoworozkurczową lewej komory (LVEDD). (D) Mikroskopia elektronowa serca wykazała nagromadzone i zdezorientowane grube włókna i przemieszczenie mitochondriów (strzałka). Linie ciągłe i kropkowane wskazują odpowiednio zewnętrzną średnicę wewnętrzną i wewnętrzną średnicę rdzenia. Panel dolny to powiększenie pola w prawym górnym panelu, pokazujące ultrastrukturę nagromadzonych włókien miozyny w kardiomiocytach. (E) Immunoblotting białek z serc ujawnił akumulację nierozłożonej (frakcja cytosolowa, 3 górne panele) i zdegradowaną (frakcja peletkowa, dolne 2 panele). / Wolne MHC w mięśniu DKO. Wyrażenie. -MHC pozostało niezmienione. (F) Ekspresja markerów hipertroficznych ANF i y / wolna MHC oceniana za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym. Wyrażenie. -MHC pozostało niezmienione. P <0,01 versus WT i MuRF1 (3); * P <0,01 versus MuRF3. / .. Pręty skali: mm (A, góra); 20 m (A, dół); 2 m (D). MuRF1 i MuRF3 oddziałują z białkami MHC i ich ubikwityną in vitro. Aby zacząć definiować mechanistyczną podstawę akumulacji MHC w mięśniach DKO, testowaliśmy, czy MuRF1 i MuRF3 oddziałują z białkami. / Wolne MHC i MHCIIa. Rzeczywiście, interakcja białek MuRF1 i MuRF3 z regionami N-końcowymi a / powolnego MHC i MHCIIa była wyraźnie widoczna w testach koimmunoprecypitacji wykorzystujących transfekowane komórki COS-7 in vitro (Figura 4A). W wiązaniu pośredniczyły subfragmenty S1 i S2 miozyny, które zawierają kulistą domenę głowy, odpowiedzialną za powstawanie mostków przejściowych zależnych od ATP między grubymi i cienkimi włóknami i długą domeną a-helisy, która jest ważna dla dimeryzacji miozyny. Zastosowaliśmy rekombinowane białka kodujące N-końcowe regiony MuRF oddziałujące z / powolnym MHC i białkiem MHCIIa do kolejnych testów ubikwitynacji in vitro. Stwierdziliśmy, że zarówno reszty ubikwitynacyjne MuRF1 i MuRF3 w obrębie N-końca a / wolne MHC (Figura 4B), jak również MHCIIa (Suplementowa Figura 5A). Następnie systematycznie testowaliśmy serię enzymów koniugujących ubikwitynę E2 pod względem ich zdolności do współpracy z MuRF1 i MuRF3 do ubikwitynacji (3 / wolnej MHC i MHCIIa i stwierdzono, że MuRF1 i MuRF3 stosują enzymy koniugujące ubikwitynę E2 UbcH5a, -b i -c. oraz w mniejszym stopniu UbcH2 w celu wykonania tej reakcji (Figura 4B i Dodatkowa Figura 5A). Nie zaobserwowano różnic w wydajności ubikwitynacji między tymi enzymami koniugującymi ubikwitynę E2 a MuRF1 i MuRF3, co wskazuje, że oba białka MuRF wykorzystują te same enzymy koniugujące ubikwitynę E2 do ubikwitynacji a / powolnego MHC i MHCIIa. Przeciwnie, enzymy koniugujące ubikwitynę E2 UbcH3, -6, -7 i -10 nie ułatwiały ubikwitynacji przez MuRF1 i MuRF3 (Figura 4B i Dodatkowa Figura 5A). Mutanty delecyjne RING-palca MuRF1 i MuRF3 nie były zdolne do ubikwitynacji a / powolnego MHC lub MHCIIa, niezależnie od użytego enzymu koniugującego ubikwitynę E2 (Figura 4C i Suplementowa Figura 5B). W eksperymentach kontrolnych nie wykryto niespecyficznego sygnału ubikwitynacji, co wskazuje na swoistość testów ubikwitynacji in vitro (Figura 4D). Figura 4MuRF1 i MuRF3 oddziałują z i ubikwitynatem P / wolne MHC in vitro. (A) Schematyczny schemat mapowania interakcji między MuRF1 i MuRF3 i a / wolny MHC pokazuje, że MuRF1 i MuRF3 oddziałują z wieloma domenami p / wolnym MHC. S1, subfragment 1; LMM, lekka meromyozyna. (B) Testy ubikwitynacji in vitro przeprowadzono z użyciem rekombinowanych enzymów aktywujących ubikwitynę E1, enzymów koniugujących ubikwitynę E2, MBP-MuRF1 lub MBP-MuRF3, ubikwityny i GSTA / wolny MHC. (B, C i D) Koniugaty białkowe ubikwityny zostały rozdzielone przez SDS-PAGE i wykryte przez przeciwciało przeciw ubikwitynie. Aktywność ubikwitynacyjna oceniana na podstawie detekcji wielocząsteczkowych łańcuchów multibikwitynowych. (C) Testy ubikwitynacji in vitro przeprowadzono z rekombinowanym E1; UbcH5a, -5b i -5c; ubikwityna; GSTA / wolny MHC; MBP-MuRF1 i MBP-MuRF3; i mutanty delecyjne z palcem RINGa MBP-MuRF1a RF i MBP-MuRF3a RF. Ubikwitynacyjna aktywność MuRF1 i MuRF3 w kierunku GSTA / wolna MHC została zniesiona, gdy domeny RING-palca MuRF1 i MuRF3 zostały usunięte. (D) Testy ubikwitynacji in vitro przeprowadzono z różnymi kombinacjami rekombinowanego E1, UbcH5c, ubikwityny, GSTA / wolny MHC i MBP-MuRF3. Nie wykryto koniugatów białka ubikwityny, gdy zastosowano GST lub białka MBP (2 skrajne prawe paski panelu) zamiast GSTA / wolny MHC, potwierdzając specyficzność testu. MuRF1 i MuRF3 pośredniczą w / powolnym ubikwitynie MHC i obrocie in vivo [więcej w: rozmowa kwalifikacyjna przykład, rozdrabniacz uniwersalny, wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy ] [podobne: ursus 8014h, przetrząsaczo zgrabiarka, przetrząsarko zgrabiarka ]