Kumulacja miozyny i miopatia mięśni poprzecznie prążkowanych wynikają z utraty palca 1 i 3 mięśnia ad 9

Barwienie srebrem białek z mięśnia sercowego wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (50). Kontrolne ładowanie wykryto przeciwciałem anty-GAPDH (monoklonalnym, Millipore) i anty-aktynowym (monoklonalnym, Sigma-Aldrich). Badanie ubikwitynacyjne in vitro i spektrometria masowa. Testy ubikwitynacji in vitro przeprowadzono zgodnie z publikacją (52). Krótko mówiąc, 500 ng MBP-MuRF1, MBP-MuRF1. RF, MBP-MuRF3 lub MBP-MuRF3. . RF; 500 ng GSTy / wolny MHC lub GST-MHCIIa; 0,3 (3 M oczyszczonego enzymu aktywującego ubikwitynę E1 (Boston Biochem); 40 mg / ml ubikwityny (Sigma-Aldrich); 8 mM ATP (Sigma-Aldrich); i (3 M enzymu koniugującego ubikwitynę E2, jak wskazano na Figurze 4B (Boston Biochem), inkubowano w 100 mM Tris-Cl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, mM DTT, 50 pM MG132 i 2 mM inhibitory proteazy NaVO4. (Complete, Roche Diagnostics) przez 2 godziny w temperaturze 30 ° C. Koniugaty ubikwityna-białko rozdzielono przez SDS-PAGE i wykryto przeciwciałem anty-ubikwitynie (poliklonalne; Santa Cruz Biotechnology Inc.). Aktywność ubikwitynacyjną oceniano przez wykrywanie wielocząsteczkowych łańcuchów wielobikwitynowych. Spektrometrię mas przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi publikacjami (53). Półilościowy RT-PCR. Całkowity RNA wyizolowano z mięśni szkieletowych i lewej komory myszy przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen). Całkowity RNA poddano trawieniu DNAzy, a syntezę cDNA 1,5. G RNA przeprowadzono przy użyciu SuperScript, systemu syntezy pierwszej nici do RT-PCR (Invitrogen). PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu SYBR Green (ABI) z zestawami starterów i warunkami PCR, które zostały wcześniej opublikowane (50) lub TaqMan Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems) z dostępnymi w handlu zestawami starterów i sond, jak opisano wcześniej (10, 51). ). Statystyka. Wartości są przedstawione jako średnie. SEM. Ekspresję genu znormalizowano do mRNA GAPDH i obliczono jako zmianę względną. Różnice w parametrach morfologicznych, fizjologicznych i biochemicznych pomiędzy grupami analizowano za pomocą testu U Manna-Whitneya lub testu dwustronnego ucznia. Statystyki zostały obliczone za pomocą oprogramowania Microsoft Excel 2002 i SPSS 11.0. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Materiały uzupełniające Przegląd danych uzupełniających Podziękowania Dziękujemy Dennisowi Burnsowi za wnikliwe komentarze i porady dotyczące zdjęć z mikroskopii elektronowej, Laurie Muller, za pomoc techniczną w mikroskopii elektronowej, Regeneron Pharmaceuticals for MURF1. /. myszy, Jennifer Brown do pomocy redakcyjnej, a Alisha Tizenor do grafiki. Dziękujemy Igorowi Rybkinowi, Kunhua Song i Matthew Potthoffowi za pomocne dyskusje. EN Olson jest wspierany przez granty z NIH, Donald W. Reynolds Cardiovascular Clinical Research Center i Fundacji Roberta A. Welcha. J. Fielitz był wspierany przez stypendium Stowarzyszenia Dystrofii Mięśni i stypendium Pfizer Niemieckiego Towarzystwa Kardiologicznego. Przypisy Niestandardowe skróty: ANF, przedsionkowy czynnik natriuretyczny; DKO, MuRF1a / yMURF3a / 5; MHC, ciężki łańcuch miozyny; MSM, miopatia do przechowywania miozyny; MuRF, palec palca mięśnia; PTU, propylotiouracyl; UPS, system proteasomów ubikwityny. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 2486. 2495 (2007). doi: 10.1172 / JCI32827
[patrz też: nafta kosmetyczna z olejkiem rycynowym, polskie towarzystwo medycyny estetycznej, rozmowa kwalifikacyjna przykład ]
[hasła pokrewne: testy z pierwszej pomocy, szpital na szaserów warszawa, czy pasujemy do siebie test ]