Kumulacja miozyny i miopatia mięśni poprzecznie prążkowanych wynikają z utraty palca 1 i 3 mięśnia ad 8

Mięśnie szkieletowe i serca zebrano, utrwalono za pomocą 3,7% paraformaldehydu, przetworzono i wybarwiono H & E, jak opisano wcześniej (10). Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu Leica DM2000 i aparatu cyfrowego z aparatem ze sprzężeniem ładunkowym Optronics DEI-750 i analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ 1.62c (http://rsb.info.nih.gov/ij/) w celu obliczenia pola przekroju myofiber. Mikroskopię elektronową wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (10). W skrócie, mięsień płaszczkowaty i tkankę przegrody międzykomorowej serca 8-tygodniowych samców z miotu WT, myszy MuRF1a / a, MuRF3a / a i DKO wycięto i utrwalono w 2% aldehydem glutarowym w 0,1 M buforze kakodylowym przez noc. w 4 ° C. Tkankę tę utrwalono i barwiono 1% tetratlenkiem osmu w 0,1 M buforze kakodylowym, inkubowano z octanem uranu i odwadniano etanolem. Następnie tkanki przepłukano tlenkiem propylenu i zatopiono za pomocą EMBED 812. Przekroje podłużne i cienkie (60 nm) wybarwiono kontrastowo octanem uranu i cytrynianem ołowiu i zbadano pod mikroskopem elektronowym Jeol 1200. Zdjęcia zostały zrobione przy powiększeniach wskazanych w legendach figur. Analiza immunohistochemiczna i metachromatyczne oznaczenia mięśni szkieletowych. Mięsaki Soleus, piszczelowe przednie, prostownikowe i mięśnie brzuchatego mięśnia zebrano od myszy WT, MuRF1a / a, MuRF3a / a i DKO i zamrożono przez zamrożenie w podłożu zawierającym mieszaninę 3: Tissue Freezing Medium ( Triangle Biomedical Sciences) i gumy tragakantowej (Sigma-Aldrich) lub utrwalone w 4% paraformaldehydzie i przetworzone w rutynowej histologii parafinowej. Zamrożone skrawki pocięto na kriotomie i zabarwiono histochemicznie na aktywność enzymatyczną ATPazy lub zmodyfikowany trichromat Gomori, jak opisano wcześniej (18, 21); Adeninowy dinukleotyd dinukleotydu zredukowanego dikotynoaminoadynem i Trichrome Gomori Step z Light Green zostały zakupione odpowiednio od Sigma-Aldrich i Poly Scientific. Parafinę i zamrożone skrawki histologiczne wybarwiono immunohistochemicznie dla p / wolne MHC (NOQ7, monoklonalne, Sigma-Aldrich), pan-MHCII (My32, monoklonalne, Sigma-Aldrich), lamininę (poliklonalną, Sigma-Aldrich) i dystrofinę (monoklonalne; Chemicon). Hodowla komórkowa, transfekcja i koimmunoprecypitacja. Eksperymenty z hodowlą komórkową przeprowadzono z użyciem komórek Cul-7 i C2C12 utrzymywanych w zmodyfikowanej przez Dulbecco żywicy Eagle a uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM l-glutaminą i penicyliną / streptomycyną i transfekowano stosując odczynnik do transfekcji FuGENE 6 (Roche Applied). Science) i Lipofectamine and PLUS Reagent (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta, odpowiednio. Różnicowanie komórek C2C12 indukowano 24 godziny po transfekcji w punktach czasowych wskazanych na Figurze 5D stosując DMEM uzupełniony 2% surowicą końską, 2 mM l-glutaminą i penicyliną / streptomycyną. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w dwóch powtórzeniach co najmniej 3 razy. Wcześniej opublikowano plazmidy ekspresyjne zawierające aminoterminalne FLAG- i Myc pochodne MuRF3 (7, 10). Plazmidy ekspresyjne zawierające aminoterminalne znaczniki FLAG i karboksyterminalne znaczone Myc pochodne MuRF1 i MuRF3 i aminoterminalne znaczniki Myc. / Wolne MHC i MHCIIa wytworzono przy użyciu polimerazy DNA HighFidelity Taq przy użyciu mysiego cDNA jako matrycy. W przypadku rekombinowanych białek, MuRF1 i MuRF3 o pełnej długości i usuniętym palcem (. . RF) subklonowano do plazmidów ekspresyjnych pMAL-c2x (NEB) i fragmenty DNA kodujące aminokwasy 2. 128 WT. / Wolne MHC i. aminokwasy 2 ~ 255 WT MHCIIa subklonowano do wektora pGEX-4T1. W badaniach immunoprecypitacji komórki zebrano w buforze do lizy (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, mM EDTA, 1% Triton X-100, mM PMSF) i uzupełniono inhibitorami proteazy (Complete, Roche Diagnostics), i Białka znakowane FLAG i myc poddano immunoprecypitacji za pomocą koniugatu M2-agaroza (Sigma-Aldrich) i przeciwciała przeciw-myc (poliklonalne, Santa Cruz Biotechnology Inc.), odpowiednio, jak opisano wcześniej (10). Związane białka rozdzielono przez SDS-PAGE, przeniesiono na membrany PVDF i poddano immunoblottingowi stosując przeciwciało anty-Myc (poliklonalne, A-14, Santa Cruz Biotechnology Inc.) lub przeciw-FLAG (monoklonalne, M2, Sigma-Aldrich). Kontrolne ładowanie wykryto z przeciwciałem anty-tubulinowym (monoklonalnym, Sigma-Aldrich) lub anty-GAPDH (monoklonalnym; Millipore). Białka wizualizowano za pomocą układu chemiluminescencyjnego (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Analizę Western blot przeprowadzono również na próbkach białek z mysich serc i mięśni szkieletowych, jak opisano wcześniej (10, 51) przy użyciu antynie / wolnej MHC (NOQ7, monoklonalne, Sigma-Aldrich), anty-pan-MHCII (My32, monoklonalne Sigma-Aldrich) lub przeciwciało anty-MHCIIa (przeciwciało sc-71 było darem od Zhen Yan, Duke University, Durham, North Carolina, USA)
[podobne: testy z pierwszej pomocy, ursus koszalin, polipektomia endoskopowa ]
[hasła pokrewne: olej kokosowy organiczny, polipektomia endoskopowa, tomografia komputerowa gdynia ]