Hematopoetyczne komórki macierzyste rozmnażają się do momentu narodzin i wykazują odwracalną wadę wszczepienia w fazie cd

Te podzbiory zostały wyizolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie (FACS) na podstawie ich barwienia Hst i Pyronin Y (Py) (32). Reprezentatywny profil FACS komórek zabarwionych Hst i Py przedstawiono na Figurze 2A. Połączone wyniki testów in vivo sortowanych komórek 14,5-dpc z 4 niezależnych doświadczeń pokazano na Figurze 3 i wskazują, że cała przeszczepialna aktywność CRU była ograniczona do frakcji G1 / S / G2 / M. W oparciu o całkowitą liczbę oznaczonych komórek G0, odsetek HSC spoczynkowych oceniono na mniej niż 0,02%. Rysunek 2 Profile FACS rozkładu komórek G0, G1 i S / G2 / M w różnych liniach. populacje. (A) Reprezentatywny wykres warstwowy FACS dla 14,5-dpc Ter119. Komórki FL po barwieniu Hst i Py oraz Ki67. (B) Reprezentatywny wykres konturu FACS dla lin. 3-wk komórki BM po barwieniu Hst i Py; posortowane komórki G0 po barwieniu dla Ki67 (> 90% komórek G0 nie wykazywało ekspresji Ki67); i posortowane komórki G1 / S / G2 / M po barwieniu dla Ki67 (> 99% komórek G1 / S / G2 / M wyrażonych Ki67). (C) Reprezentatywne wykresy konturowe FACS dla lin. 4- i 10-tygodniowe komórki BM po barwieniu Hst i Py. Procenty wskazują odsetek wszystkich komórek znalezionych we wskazanym genie. Rysunek 3 Aktywność rowerowa części CRU jest zmniejszona w wieku od 3 do 4 tygodni. Pokazano liczbę CRU na 105 początkowych komórek żywych. Komórki FL były zubożone w komórkach Ter119 +; w przypadku komórek BM 3- i 4-wk usunięto wszystkie komórki lin + oprócz komórek Mac1 +; a w przypadku 10-tygodniowych komórek BM, wszystkie komórki lin +, w tym komórki Mac1 +, zostały usunięte. Wartości są średnie. SEM z danych zebranych z co najmniej 3 eksperymentów na tkankę. ** P <0,001. HSC ulegają całkowitej i nagłej zmianie w aktywności rowerowej między 3 a 4 tygodniem po urodzeniu. Ponieważ wiadomo, że HSC są obecne w BM myszy płodowych w późniejszych okresach ciąży, interesujące było zbadanie, czy HSC najpierw staną się niespokojne u płodu w tym miejscu. Aby odpowiedzieć na to pytanie, wykorzystaliśmy 16-godzinny test samobójczy 3H-TDR, aby określić status cyklu CRU obecnych w BM myszy na poziomie 18,5 dpc. Dla porównania oceniliśmy również status cyklu CRU w 18,5-dpc FL. Częstotliwość CRU w tych 2 tkankach wynosiła na 105 i na 7 × 104 całkowitych komórek jądrzastych (Tabela uzupełniająca 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI28310DS1); tj. odpowiednio około 5- i 3,5-krotnie mniej niż w dorosłym BM (1 na 2 × 104 wszystkich komórek jądrzastych, pozycja 33) i odpowiednio 6- i 4-krotnie mniej niż w 14,5-dpc FL ( na 1,7 × 104 całkowitych komórek jądrzastych, odnośnik 33). Po całonocnej ekspozycji na wysoką aktywność specyficzną 3H-Tdr, nie wykryto CRU w zawiesinach komórek 18,5-dpc płodowego BM lub komórek 18,5-dpc FL, w przeciwieństwie do komórek kontrolnych inkubowanych w tej samej pożywce bez 3H- Tdr (rysunek 1B). Tak więc wydaje się, że wszystkie HSC płodu, niezależnie od ich lokalizacji, szybko się rozprzestrzeniają. W celu dokładniejszego zbadania tempa i czasu przejścia HSCs w w dużej mierze spoczynkową populację, przeanalizowaliśmy status kolizji części CRU w lin. Zawiesiny komórek BM od myszy 3- i 4-tygodniowych (odstawiających) (odpowiednio, lin 3- i 4-wk BM). W początkowych eksperymentach częstotliwości CRU w lin. Stwierdzono, że komórki BM 3- i 4-tygodniowe są takie same (1 na 6,5 x 103 i na 6,3 x 103 komórek linf, Tabela dodatkowa 2), około 2 razy mniej niż w linku. 10-tygodniowe komórki BM (młode dorosłe myszy, na 2,9 x 103 komórek linowych). Następnie frakcjonowaliśmy 3- i 4-wk BM komórki FACS w ich podzestawach G0 i G1 / S / G2 / M składowych w oparciu o bramki pokazane na lewym panelu na Rysunku 2, B i C oraz posortowane G0 i G1 / Komórki S / G2 / M testowano oddzielnie dla aktywności CRU. Reanaliza sortowanych frakcji G0 i G1 / S / G2 / M po barwieniu dla Ki67 potwierdziła, że komórki eksprymujące ten marker proliferacji były ograniczone do tych, które określiliśmy jako G1 / S / G2 / M (Figura 2B). Co godne uwagi, wyniki testów in vivo wykazały, że wszystkie CRU wykryte w 3-wk BM były również ograniczone do frakcji G1 / S / G2 / M, podczas gdy ponad 98% CRU w 4-wk BM znaleziono w frakcji G0 (Figura 3). Tak więc nastąpił szybki spadek aktywności proliferacyjnej CRU w BM myszy w wieku 3 do 4 tygodni przy niewielkiej zmianie liczby CRU. HSC w S / G2 / M wykazują swoistą i odwracalną wadę wszczepienia niezależnie od ich początkowego pochodzenia lub drogi wstrzyknięcia do biorców testu. Biorąc pod uwagę poprzednio zgłoszoną wadę wszczepienia dorosłych HSC stymulowanych do S / G2 / M (19), interesujące było ustalenie, czy liczba proliferujących HSC obecnych we wczesnym stadium rozwoju może być rutynowo niedoceniana z powodu niemożności wykrycia tych w S / G2 / M [więcej w: okulistyka ceglana katowice, ursus 11054, czy pasujemy do siebie test ] [przypisy: przetrząsaczo zgrabiarka, przetrząsarko zgrabiarka, rozdrabniacz uniwersalny ]