Hematopoetyczne komórki macierzyste rozmnażają się do momentu narodzin i wykazują odwracalną wadę wszczepienia w fazie ad 8

Wzbogacone populacje HSC uzyskano przez immunomagnetyczne usunięcie komórek Ter119 + lub lin + z odpowiednio zawiesin komórek FL i BM (stosując EasySep; StemCell Technologies). Przeciwciała stosowane do izolacji lin. komórki między 4 a 10 tygodniem życia były anty-B220, Ter119, anty-Gr1, anty-Ly1 i anty-Mac1 (StemCell Technologies). Aby wyizolować lin. komórki z 3-tygodniowych myszy, przeciwciało Mac1 zostało pominięte, ponieważ wiadomo, że Mac1 ulega ekspresji w HSC płodu i cyklu (13, 14, 73). Trytogenne badanie samobójcze 3H-Tdr. Komórki zawieszono w stężeniu 106 / ml w pożywce Iscovex zawierającej 5 x 10 5 mol / l 2-merkaptoetanol, substytut surowicy (BIT 9500, StemCell Technologies) i 50 ng / ml mysiego SF (StemCell Technologies). Równe objętości inkubowano następnie w 37 ° C w 5% CO2 na powietrzu przez 16 godzin na szalkach Petriego o średnicy 35 mm w obecności lub przy braku 20 CiC / ml 3H-Tdr (25 Ci / mmol, Amersham Biosciences). Następnie komórki zebrano i przemyto dwukrotnie pożywką Iscovera zawierającą 2% FCS i przeprowadzono testy CRU z ograniczonym rozcieńczeniem. Izolacja FACS i analiza komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Komórki zawieszono w HF / 2 zawierającym .g / ml Hst (Invitrogen) i albo 10 .l / l fumitremorgin C (dar od S. Bates, NIH, Bethesda, Maryland, USA) lub 50 .Mol / l rezerpiny ( Sigma-Aldrich), a następnie inkubowano w 37 ° C przez 45 minut. Dodano Py (Sigma-Aldrich) przy stężeniu .g / ml, a komórki inkubowano przez kolejne 45 minut w 37 ° C. Komórki przepłukano dwukrotnie w HF / 2 za pomocą .g / ml PI (Sigma-Aldrich) w drugim przemyciu i ostatecznie zawieszono ponownie w HF / 2 za pomocą PI i trzymano na lodzie w ciemności aż do posortowania (tylko komórki PI3). na 3-laserowym FACSVantage (BD). W celu analizy zawartości DNA, komórki albo zostały przywrócone do Hst tylko przy użyciu tego samego protokołu albo wybarwione PI co najmniej godzinę po przechowywaniu w 4 ° C komórek, które zostały dwukrotnie przemyte w lodowatym PBS z 0,1% glukozy i utrwalone w ml lodowato zimnego 70% etanolu. W celu wybarwienia PI, komórki przemyto dwukrotnie 2% PBS i ponownie zawieszono w PBS z 0,1% glukozy, 5 ug / ml PI i 200 ug / ml RNazy A. Komórki następnie inkubowano przez co najmniej godzinę w 4 ° C. C i analizowane bezpośrednio na FACSCalibur (BD). W celu wybarwienia posortowanych komórek dla Ki67, komórki przemyto, zawieszono ponownie w 50 (ll lodowatego 80% etanolu i inkubowano w <20 ° C przez co najmniej 2 godziny. Stałe komórki przemyto dwukrotnie w 300 ul PBS z 1% FCS i 0,09% NaN3 (pH 7,2). Następnie dodano skoniugowane z FITC przeciwciało anty-ludzkie Ki67 (BD) i komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Komórki następnie analizowano za pomocą FACS, z komórkami barwionymi sprzężoną z FITC mysią IgG1 (BD) służącą jako kontrola. Traktowanie HSC S / G2 / M in vitro. Posortowane komórki inkubowano w 37 ° C w 5% CO2 w powietrzu w studzienkach płytki 96-studzienkowej z okrągłym dnem w pożywce bez surowicy (jak w testach samobójczych 3H-Tdr) z z następujących 6 dodatków: 100 ng / ml CXCL12 (prezent od I. Clark-Lewis, University of British Columbia, Vancouver, Kolumbia Brytyjska, Kanada) lub 300 ng / ml SDF-1G2 (również prezent od I. Clark-Lewis, teraz dostępny w cenie żądany peptyd z Centrum Biomedycznego, University of British Columbia), ale bez SF; Sam 50 ng / ml SF; 50 ng / ml SF plus 100 ng / ml CXCL12 lub 300 ng / ml CXCL12; lub 300 ng / ml SDF-1G2. Następnie komórki zebrano ze studzienek i równe dawki wstrzyknięto myszom biorcy tak, że każda mysz otrzymała odpowiednik 4 x 103 początkowych komórek G1 lub 1,2 x 104 początkowych komórek S / G2 / M. Test CRU. Myszy biorców (W41 / W41) poddano działaniu subletalnych napromieniowań za pomocą 400 cGy 137Cs-promieni lub 360 cGy 250 kVp promieni rentgenowskich, a następnie wstrzyknięto dożylnie komórki testowe, z wyjątkiem przypadków, gdy wstrzyknięto to intrafemalnie, jak wskazano. Wstrzyknięcia wewnątrzustne wykonano jak opisano wcześniej (74). Części CRU zidentyfikowano poprzez ich zdolność do generowania komórek krwi . dawcy typu Ly5, w tym komórek Ly1 + (komórki T), B220 + (komórka B) i Gr1 / Mac1 + (granulocytów / monocytów), które można było wykryć 16 tygodni lub później po transplantacja (75). Częstotliwość CRU obliczono przy użyciu programu L-calc (StemCell Technologies) z proporcji myszy, którym podano różne dawki komórek testowych, które były ujemne dla tego punktu końcowego. Osobnikom traktowanym SDF-1G2 wstrzyknięto dożylnie 10 .g na mysz SDF-1G2 rozpuszczonego w PBS 2 godziny po napromieniowaniu, a następnie przesadzono kolejne 2 godziny później. Ten schemat zastosowano w celu zminimalizowania bezpośredniego oddziaływania wstrzykniętych HSC z SDF-1G2 w krążeniu (w oparciu o prawdopodobny szybki klirens SDF-1G2) i maksymalizacji jakiegokolwiek potencjalnego wpływu na gospodarza przez utrzymywanie odstępu między SDF-a Wstrzyknięcie 1G2 i przeszczep jak najkrótszy [patrz też: rehabilitacja po złamaniu szyjki kości udowej, rozmowa kwalifikacyjna przykład, przetrząsaczo zgrabiarka ] [więcej w: ursus 11054 cena, czy pasujemy do siebie test, okulistyka ceglana katowice ]