Hematopoetyczne komórki macierzyste rozmnażają się do momentu narodzin i wykazują odwracalną wadę wszczepienia w fazie ad 5

Jednakże mobilizacja prymitywnych komórek krwiotwórczych może być również stymulowana przez blokowanie przekazywania sygnałów CXCL12 / CXCR4, jak osiągnięto przez podawanie AMD3100 in vivo, antagonisty CXCL12 (40). Ponadto ostatnio wykazano, że podawanie AMD3100 in vivo może zwiększać konkurencyjność zdolności wszczepiania przeszczepionych komórek BM w nienapromieniowanych gospodarzach (41). Odkrycia te sugerują, że celowanie w szlak CXCL12 / CXCR4 może również wpływać na zmienne właściwości wszczepiania HSC na rowerze przez wpływ na same HSC lub przeszczepiony gospodarz. Aby zbadać te możliwości, najpierw zapytaliśmy, czy uprzednio poddaje się przeszczepianiu HSC, czy też gospodarzom ze swoistym antagonistą CXCL12 może zmienić poziom repopulacji uzyskany 16 tygodni później. Antagonistą CXCL12 stosowanym w tych doświadczeniach był SDF-1G2 (zwany również P2G, ponieważ jest identyczny z czynnikiem pochodzącym z komórki zrębowej, z tym wyjątkiem, że prolina w pozycji 2 została przekształcona w glicynę, pozycja 42). SDF-1G2 jest więc strukturalnie zupełnie odmienny od AMD3100, ale ma podobną zdolność blokowania wiązania CXCL12 z CXCR4 bez aktywacji CXCR4 (42, 43). SDF-1G2 i AMD3100 mają również zdolność wywoływania efektów na prymitywne komórki krwiotwórcze, zarówno in vitro, jak i in vivo (44). Myszom wstrzyknięto 10 .g SDF-1G2 lub PBS 2 godziny przed przeszczepieniem komórek G1 sortowanych FACS lub S / G2 / M i analizowano pod kątem obecności komórek krwi pochodzących od dawcy 16 tygodni później, a wyniki dla 14,5-dpc FL i 3-wk BM były podobne (ryc. 5A). Traktowanie biorców za pomocą SDF-1G2 nie miało wpływu na aktywność repopulacyjną CRU w G1. Przeciwnie, wstępne traktowanie SDF-1G2 przez biorców komórek S / G2 / M umożliwiło łatwe wykrycie długoterminowej populacji wielopoziomowej (u 7 i 4 myszy po 10 przeszczepionych 14,5-dpc FL i 3-wk BM / G2 / M komórki, odpowiednio, w stosunku do 0 z 10 w kontrolach wstrzykiwanych PBS dla każdego). Co więcej, gospodarze uprzednio traktowani SDF-1G2a wykazywali poziomy repopulacji przez oba źródła komórek S / G2 / M, które były nie do odróżnienia od tych obserwowanych u myszy z przeszczepionymi komórkami G1 (Figura 6). Z drugiej strony, gdy SDF-1G2 był podawany bezpośrednio do komórek, które mają być przeszczepione przez 30 minut przed wstrzyknięciem, nie zaobserwowano różnicy w aktywności wszczepiania przeszczepionych komórek G1 lub S / G2 / M w porównaniu z nieleczonymi kontrolami w szerokim zakresie. zakres badanych stężeń SDF-1G2 i CXCL12, z dodatkiem lub bez dodatku SF (Figura 5B). Figura 6 Pochodząca z urodzenia populacja myszy traktowanych SDF-1G2a. Pokazano reprezentatywne profile FACS komórek specyficznych dla dawcy wykrytych po dwukrotnym barwieniu dla allotypu typu Ly5 typu donorowego i różnych markerów specyficznych dla linii. (A) Przykład pozytywnie wszczepionego traktowanego PBS biorcy komórek FL w G1. (B) Przykład pozytywnie wszczepionego traktowanego SDF-1G2a biorcy komórek FL w S / G2 / M. (C) Przykład potraktowanego PBS biorcy komórek FL w S / G2 / M, który nie wykazywał hematopoezy pochodzącej od dawcy. Liczby na wykresach wskazują odsetek całkowitych komórek znalezionych we wskazanym genie. HSC w S / G2 / M wyrażają wyższe poziomy transkryptów CXCL12 niż HSC w G1. Aby zacząć rozumieć mechanizm za obserwowanym defektem wszczepienia HSC S / G2 / M i jak można go pokonać przez wstępne traktowanie SDF-1G2 gospodarza, wyizolowaliśmy wysoce oczyszczone populacje HSC z 14,5-dpc FLs i 3-wk BM (komórki Lin-Sca-1 + CD43 + Mac1 + reprezentujące około 20% czystych HSC, MB Bowie i CJ Eaves, niepublikowane obserwacje) i posortowano je na odpowiadające im frakcje G0 / G1 i S / G2 / M przez barwienie Hst. Próbki w przybliżeniu 200. 800 komórek zebrano z każdej frakcji w 3 niezależnych doświadczeniach sortowania i poziomy transkryptu dla Gapdh, c-Kit, c-mpl, CD44, integryny a4 (a4int), VCAM1, CXCR4 i CXCL12 były mierzono za pomocą ilościowej analizy cDNA w czasie rzeczywistym przygotowanej z izolowanych ekstraktów RNA, jak opisano w Methods. Transkrypty wszystkich tych genów były konsekwentnie wykrywane zarówno w frakcjach G0 / G1, jak i S / G2 / M wysoko oczyszczonych zawiesin HSC z 14,5-dpc FL i 3-wk BM, w tym CXCL12, które wcześniej nie wykazywały wyrażone przez HSC (rysunek 7). Co ciekawe, CXCL12 był również jedynym z ocenianych genów, który, jak stwierdzono, ulega ekspresji na znacząco różnych poziomach w HSO G0 / G1 i S / G2 / M (9-krotnie wyższy w HSC S / G2 / M; P <0,05) . Figura 7 Analiza ekspresji genów podgrup G1 i S / G2 / M wysoko oczyszczonych lin. Sca1 + CD43 + Mac1 + HSC z 14.-DC FL i 3-wk BM [hasła pokrewne: ursus 8014h, olej kokosowy organiczny, rozdrabniacz uniwersalny ] [patrz też: rehabilitacja po złamaniu szyjki kości udowej, szczecin szpital wojskowy, rozmowa kwalifikacyjna przykład ]