Dysfunkcja cholinergiczna w mysim modelu choroby Alzheimera jest odwracana przez anty-A przeciwciało czesc 4

A. peptyd był koimmunoprecypitowany z ekstraktów hipokampalnych wytworzonych z myszy transgenicznych PDAPP przez przeciwciało anty-ChT-1, a następnie analiza Western błot z biotynylowanym anty-A. przeciwciała 21F12 i 2G3. (E) Przeciwciało anty-Ap42 21F12, ale nie przeciwciało 2G3 przeciw A.40, koimmunoprecypitowane ChT-1 z ekstraktów hipokampalnych wytworzonych z transgenicznych myszy PDAPP, a następnie analiza Western blot z przeciwciałem anty-ChT-1. (F) Ani nieistotna IgG, ani przeciwciało transportujące anty-glutaminian (EAAT-1) nie powodują koimmunoprecypitacji A. z ekstraktów hipokampalnych przygotowanych z myszy PDAPP, podczas gdy A. łatwo wykryto po immunoprecypitacji z przeciwciałem skierowanym przeciwko ChT-1, a następnie analizą Western blot z użyciem anty-A (3; przeciwciało. Od wysoce hydrofobowej natury A. może spowodować niespecyficzne powiązanie z ChT-1, przeprowadziliśmy eksperymenty koimmunoprecypitacji z przeciwciałem skierowanym przeciwko transporterowi glutaminianu-1, jak również z nieistotnym IgG. Nie wykryliśmy żadnego A. gdy homokulaty hipokampu od myszy PDAPP poddano immunoprecypitacji przeciwciałem transportera anty-glutaminian-1 lub nieistotnej IgG, a następnie sondowano na obecność A (3; (Figura 3F). Absorpcja choliny o wysokim powinowactwie do synaptosomów hipokampalnych jest zwiększona u myszy PDAPP. Ponieważ etapem ograniczającym szybkość w biosyntezie ACh jest pochłanianie zewnątrzkomórkowej choliny przez neuronowe wysokie powinowactwo ChT-1, następnie określiliśmy poziom mRNA ChT-1 u myszy PDAPP i WT, ponieważ zmniejszenie ekspresji ChT-1 może wyjaśnić obniżone poziomy podstawowe ACh i wyższe poziomy zewnątrzkomórkowej choliny w mózgu. Nie stwierdzono znaczącej różnicy w poziomie mRNA chT-1 hipokampu między kontrolami PDAPP i WT, jak określono za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Figura 4) w wieku 2 lub 17 miesięcy. Co ciekawe, stwierdziliśmy zależny od wieku wzrost poziomu mRNA ChT-1 u myszy WT i PDAPP (Figura 4). Aby dokładniej zbadać funkcjonalne konsekwencje A. nadekspresję transportu choliny o wysokim powinowactwie, mierzono wychwyt choliny o wysokim powinowactwie przez ChT-1 w synaptosomach hipokampa z myszy WT i PDAPP. Hipokamp wybrano ze względu na dobrze scharakteryzowaną unerwienie cholinergiczną w tym obszarze mózgu, a także obecność wysokich poziomów A. peptyd u myszy PDAPP (14, 19. 22). Analiza kinetyczna wychwytu choliny o wysokim powinowactwie w synaptosomach hipokampalnych PDAPP lub WT wykazała znaczący wzrost (50,9%, P <0,05) w Vmax wychwytu choliny u myszy kontrolnych PDAPP i myszy WT, bez mierzalnej zmiany pozornego Km (Tabela 1). ). Figura 4 Poziom reaktywnego mRNA dla ChT-1 w hipokampie młodych (2 miesiące) i starych (17 miesięcy) myszy transgenicznych WT i PDAPP, jak określono za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. n = 5 myszy na grupę. ** P <0,01, * P <0,05 w stosunku do odpowiednich 17-miesięcznych grup. Tabela 1Kinetyki wychwytu choliny do synaptosomów hipokampa Anty-A. leczenie przeciwciałem przywraca profil uwalniania hipokampa ACh u myszy PDAPP. Następnie zbadaliśmy, czy ostre leczenie anty-A z wysokim powinowactwem. przeciwciało m266 może przywrócić homeostazę hipokampa ACh, ponieważ wcześniej wykazaliśmy, że ostre leczenie myszy PDAPP za pomocą m266 było w stanie odwrócić deficyty pamięci bez jakiegokolwiek wpływu na mózg A. obciążenie i że m266 wiąże się z wysokim powinowactwem do rozpuszczalnych postaci A. (13, 23). Myszy PDAPP traktowano pojedynczą dawką m266 (500 ug) 24 godziny przed ustaleniem wyjściowych poziomów ACh. Uwalnianie ACh z hipokampa po podaniu skopolaminy myszom PDAPP, którym podawano m266 w warunkach podstawowych, nie różniło się istotnie od nietraktowanych myszy WT, ale znacząco różniło się od nieleczonych myszy PDAPP (Figura 2, B i D, P <0,05). Podobnie, gdy myszy PDAPP eksponowano na nowe środowisko po podaniu m266, wielkość i czas trwania uwalniania hipokampa ACh nie różniły się istotnie od myszy WT, ale znowu były istotnie różne od nietraktowanych myszy PDAPP (Figura 2A, P <0,05). Aby określić specyficzność leczenia m266, wykorzystaliśmy nieistotne przeciwciało IgG (izotyp dopasowane do m266), a także dodatkowe przeciwciało anty-A. przeciwciało (3D6), które rozpoznaje koniec N ludzkiego A. peptyd (20). Ani nieistotne IgG, ani 3D6 nie były zdolne do odwrócenia lub normalizacji uwalniania hipokampa ACh w odpowiedzi na nowe środowisko lub po podaniu skopolaminy (Figura 5, A i B). Jednak traktowanie 3D6, ale nie związaniem z nieistotną IgG, było w stanie przywrócić podstawowe uwalnianie ACh hipokampa po podaniu myszom PDAPP (Figura 5C) [przypisy: prawo wykonywania zawodu lekarza, przetrząsarko zgrabiarka, olej kokosowy organiczny ] [patrz też: tomografia komputerowa gdynia, świt żywych trupów cda, szpital na szaserów warszawa ]