Dysfunkcja cholinergiczna w mysim modelu choroby Alzheimera jest odwracana przez anty-A przeciwciało cd

Pozakomórkowe poziomy choliny są zwiększone w hipokampie myszy PDAPP. Czy zmniejszenie pozakomórkowej i tkankowej zawartości ACh może być spowodowane zmniejszoną dostępnością choliny prekursorowej ACh. Aby rozwiązać ten problem, określiliśmy poziom zewnątrzkomórkowej choliny za pomocą mikrodializy in vivo. Ku naszemu zaskoczeniu, pozakomórkowa cholina była znacząco zwiększona u myszy PDAPP w porównaniu z dobranymi wiekiem kontrolnymi WT (Figura 2C, P <0,05), potwierdzając w ten sposób, że zmniejszone pozakomórkowe poziomy prekursora ACh nie mogły wyjaśnić obniżonego poziomu ACh mierzonego homogenaty tkanek lub płyn zewnątrzkomórkowy z mikrodializą in vivo (patrz dyskusja). A. bezpośrednio współdziała z ChT-1. Jednym możliwym wytłumaczeniem znaczącego wzrostu pozakomórkowych poziomów choliny jest to, że A. peptyd oddziałuje bezpośrednio z ChT-1, skutecznie blokując efektywny transport i biosyntezę ACh. Aby zbadać tę możliwość, przygotowaliśmy synaptosomy ze szczurzych hipokampów i określiliśmy transport choliny o wysokim powinowactwie po ekspozycji na A (42 (Figura 3A). Występował znaczny wzrost wychwytu choliny, gdy szczurzy synaptosomy były eksponowane na Ap42 (100 nM, P <0,05). Ponieważ preparaty terminali nerwowych zawierają elementy pęcherzyków synaptycznych i A. zaobserwowano, że ma on wpływ na wiele układów wewnątrzkomórkowych, w tym pęcherzyki synaptyczne, następnie ustaliliśmy, czy wychwyt cholinowy o wysokim powinowactwie będzie podlegał wpływowi, gdy komórki eksprymujące ludzką ChT-1 były eksponowane na ludzki Ap42 (Figura 3B). Podobnie do wyników uzyskanych, gdy szczurzym synaptosomy były eksponowane na Ap42, zaobserwowano znaczny wzrost wychwytu choliny, nawet gdy komórki eksprymujące ludzką ChT-1 eksponowano na bardzo niskie stężenia AUC42 (100 nM; P <0,05) dla stosunkowo krótki (15-minutowy) okres czasu. Odwrotny peptyd (A3424) był bezskuteczny, podczas gdy zależny od A. wzrost wychwytu choliny o wysokim powinowactwie wystąpił po ekspozycji na świeżo przygotowany lub starzony peptyd Ap42 (dane nie przedstawione). Następnie użyliśmy koimmunoprecypitacji, aby określić, który z gatunków A. jest związany z ChT-1. Gdy homogenaty hipokampa przygotowane z myszy PDAPP zostały koimmunoprecypitowane za pomocą anty-A (3. przeciwciało, 4G8, prążek około 70 kDa reprezentujący ChT-1 był widoczny (Figura 3C). Odwrotnie, pasmo około 4 kDa reprezentujące A. było wyraźnie widoczne, gdy homogeni- zy hipokampa z myszy PDAPP były koimmunoprecypitowane przeciwciałem anty-ChT-1, a następnie immunoblottingiem z C-końcowym swoistym anty-A. przeciwciała 21F12 i 2G3 (Figura 3D). Nie A. wykrywano, gdy homogeni- zy hipokampu z myszy WT były koimmunoprecypitowane przeciwciałem anty-ChT-1 i sondowano anty-A (3; przeciwciała (dane nie pokazane). ChT-1 było jednak koimmunoprecypitowane z homogenatów hipokampa przygotowanych z myszy WT przez anty-A. przeciwciało 4G8 (Figura 3C). Ponieważ nasze początkowe eksperymenty koimmunoprecypitacji wykorzystywały anty-A. przeciwciało, które rozpoznaje region domeny A w środkowej domenie. Peptydem, a zatem w wyniku koimmunoprecypitacji zarówno Ap40 jak i Ap42, poszukiwaliśmy następnie możliwości określenia, który z tych dwóch lub obu rodzajów A. może wchodzić w interakcje z ChT-1. Ponownie zastosowaliśmy koimmunoprecypitację A. wykorzystując anty-A. przeciwciała selektywne dla A. peptydy kończące się 40 aminokwasami (2G3) lub 42 (21F12). Podobne do wyników otrzymanych po koimmunoprecypitacji z anty-A. przeciwciało 4G8, ChT-1 wykrywano, gdy hipokampał homogenizuje myszy PDAPP, koimmunoprecypitowano selektywnym przeciwciałem 21F12 A.42, ale nie selektywnym przeciwciałem A.40 2G3, a następnie immunoblottingiem z przeciwciałem anty-ChT-1 (Figura 3E). ). ChT-1 nie został wykryty, gdy homogeni- zy hipokampa z myszy WT były koimmunoprecypitowane albo z C-końcowym selektywnym przeciwciałem (Fig. 3E). Figura 3A. współdziała z ChT-1. (A i B) Pobór choliny o wysokim powinowactwie do synaptosomów szczura (A) i linii komórkowej wyrażającej ludzką ChT-1 (B) był znacznie zwiększony po ekspozycji na Ap42. Dane stanowią procent wychwytu choliny w nietraktowanych próbkach kontrolnych (średnia . SEM wartości potrójnych) z reprezentatywnego doświadczenia, które powtórzono 2. 3 razy z podobnymi wynikami. * P <0,05. (C) ChT-1 było koimmunoprecypitowane z ekstraktów hipokampowych przez anty-A. przeciwciała 4G8, a następnie analizy Western blot z przeciwciałem anty-ChT-1 [więcej w: polskie towarzystwo medycyny estetycznej, czy pasujemy do siebie test, nafta kosmetyczna z olejkiem rycynowym ] [hasła pokrewne: wrzodziejące zapalenie jelita grubego objawy, olej kokosowy organiczny, polipektomia endoskopowa ]