Dysfunkcja cholinergiczna w mysim modelu choroby Alzheimera jest odwracana przez anty-A przeciwciało ad 8

Aby ocenić wpływ różnych IgG (przeciwciała anty-A (m266 i 3D6 i nieistotne IgG, 500 .g ip), zastosowano ten sam eksperymentalny paradygmat opisany powyżej dla zbierania i analizowania wypływu ACh, z tym wyjątkiem, że myszom podawano IgG 24 godziny. przed początkowym pobraniem linii bazowej i 24 godziny po wszczepieniu sond. Pozakomórkowe stężenia choliny oceniano za pomocą mikrodializy in vivo zasadniczo jak opisano powyżej. Zmodyfikowany roztwór Ringera pozbawiony neostygminy poddano perfuzji i zebrano 5-minutowe próbki i analizowano w trybie on-line za pomocą HPLC-EC (38). Poziomy ACh tkanek. Poziomy ACh w homogenatach tkankowych zostały określone zasadniczo jak opisano wcześniej (39). Pokrótce, myszy szybko zdekapitowano, a obszary mózgu wypreparowano i zamrożono na suchym lodzie w ciągu 30 sekund. Tkanki homogenizowano w 10 objętościach 0,1 M kwasu trichlorooctowego zawierającego 10. M acetylotiocholiny jako wzorzec wewnętrzny. Po odwirowaniu przy 10000 g, próbki o objętości 20 .l supernatantu analizowano pod kątem ACh za pomocą HPLC-EC (39). Absorpcja choliny. Absorpcja choliny do synaptosomów hipokampa była mierzona jak opisano wcześniej (22). W skrócie, hipokampy od 4- do 6-miesięcznych myszy PDAPP i kontroli WT zostały podzielone i połączone (n = 10. 12 na eksperyment). Surowe synaptosomy przygotowano przez homogenizację tkanki w lodowatym buforze (0,32 M sacharoza, 10 uderzeń homogenizatora Dounce AA068), i określono całkowitą zawartość białka (Pierce Biotechnology) z peletek P2 po odwirowaniu (12 000 g przez 20 minut). Absorpcję choliny oznaczano w trzech powtórzeniach przez inkubację 0,1. 0,2 mg surowego białka synaptosomalnego w buforze wychwytu choliny (130 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES i 2,2 mM CaCl. pH 7,4) i [3H] choliny (86 Ci / mmol, 10 nM, PerkinElmer), z końcowymi stężeniami choliny wynoszącymi 0,03 . 5. M, przez 5 minut w 37 ° C. Pobranie zakończono przez powracanie próbek do lodu przez 5 minut, a następnie aspirację na szklane filtry powleczone polietylenoiminą (PerkinElmer). Specyficzność wychwytu określono przez odjęcie wychwytu choliny w obecności hemicholinu (10 .M). Wartości Km i Vmax określono za pomocą nieliniowej analizy regresji za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (wersja 4.03; GraphPad Software Inc.). W celu określenia wpływu m266 na wychwyt choliny o wysokim powinowactwie, myszom PDAPP podano 500 .g m266 ip na 24 godziny przed przygotowaniem synaptosomów. W celu oznaczenia wychwytu choliny o wysokim powinowactwie do szczytów nerwu hipokampa szczura, postępowano zgodnie z powyższym protokołem, z tym że użyto hipokampów od 2. 3 szczurów. Stabilną linię komórkową wyrażającą ludzką ChT-1 wytworzono po selekcji w higromycynie po transfekcji do komórek 293. W celu oznaczenia wychwytu choliny o wysokim powinowactwie komórki wysiano na płytki Cytostar T powleczone poli-L-lizyną (60 000 komórek / 100 ul, Amersham Biosciences) i inkubowano w 37 ° C przez 24 godziny przed oznaczeniem wychwytu choliny. W celu oznaczenia wychwytu o wysokim powinowactwie, pożywki usunięto i zastąpiono buforem wychwytu choliny za pomocą 14C-choliny (0,2 .Ci / ml, końcowe stężenie 3,75 .M) i inkubowano przez 70 minut w temperaturze pokojowej. Płytki zliczano w liczniku MicroBeta (PerkinElmer) przez minutę. Specyficzny wychwyt określono przez odjęcie wychwytu w obecności hemicholinu (10 .M). W celu określenia wychwytu choliny po ekspozycji na ludzkie A (312 (AnaSpec), komórki ChT-1 lub synaptosomy hipokampa szczura poddano ekspozycji na A. (0,01 – (3 M), który rozcieńczono z roztworu podstawowego (1 mM) i inkubowano przez 15 minut w 37 ° C. Absorpcję choliny oznaczono jak opisano powyżej. Koimmunoprecypitacja. Hippocampi od transgenicznych myszy PDAPP homogenizowano w buforze (1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,05% dezoksycholanu i inhibitor proteazy) i określano stężenia białka (Pierce Biotechnology). Ekstrakty hipokampa (250 .g) rozcieńczono w 250 .l PBS / 0,2% BSA przeciwciałami (2,5 .g, anty-A (3, 2G3 i 21F12, wszystkie z Senetek; 4G8 z Signet Lab Inc., Anty-ChT- 1, transporter anty-glutaminian-1 z Chemicon International, nieistotne IgG z Harlan) przez 8 godzin w temperaturze 4 ° C na kołyszącej platformie. Próbki inkubowano przez dodatkowe 16 godzin po dodaniu BSA (1%) zablokowanych kulek białkowych G (100 .l; Pierce Biotechnology). Kulki przemyto 3 razy PBS (500 ul) i białka wymywano buforem do pobierania próbek (30 ul, Novex, Invitrogen Corp.) przed frakcjonowaniem wielkości (4-12% Bis Tris gel; Bio-Rad). . Białka zostały następnie przeniesione na membrany PVDF (Bio-Rad) i sondowane przeciwciałem anty-ChT-1 (Chemicon International) lub anty-A. przeciwciała (21F12, 2G3), które były biotynylowane
[podobne: polskie towarzystwo medycyny estetycznej, czy pasujemy do siebie test, rozmowa kwalifikacyjna przykład ]
[hasła pokrewne: ursus koszalin, ursus 8014, nafta kosmetyczna z olejkiem rycynowym ]