Dryf antygenowy jako mechanizm unikania guza niszczenia przez limfocyty T cytolityczne czesc 4

Dwa enzymy nie zidentyfikowały żadnej mutacji w 37 klonach komórek nowotworowych J558-Neo. Jednak podzielili klony Tum na cztery grupy i klony Tum 2 na dwie grupy (pokazane na rysunku jako G1, G2, G3 i G4). Proporcja klonów w każdej grupie jest przedstawiona pod każdą fotografią. Wszystkie sugerowane mutacje Tum 2 i Tum oraz brak mutacji w klonach J558-Neo zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencjonowanie DNA ujawniło również, że niecięte subklony Tum 2 G2 zawierały dwie niezależne mutacje, P1A (7P) i P1A (8G). (c) Ekspresja genu P1A w klonach Tum G2. RNA wyizolowano i zastosowano do RT-PCR (ścieżka 3 i ścieżka 4). Nie obserwowano produktu, gdy nie stosowano odwrotnej transkryptazy (RT) (linia 5). Dla porównania wytworzono również produkty PCR z genomowego DNA (ścieżka i ścieżka 2). Zauważ, że chociaż genomowy DNA jest najwyraźniej heterozygotyczny w P9, tylko komórki P1A (9L) są obserwowane w komórkach nowotworowych. WT, typ dziki. Przeprowadziliśmy dwa rodzaje eksperymentów, aby zidentyfikować zmiany genetyczne w genie P1A w dwóch liniach komórek nowotworowych ex vivo. Najpierw, stosując rozcieńczenia graniczne, uzyskaliśmy ponad 30 klonów z każdej z linii rodzicielskich J558-Neo, Tum i Tum 2, a następnie przeanalizowano je pod kątem obecności mutacji w P6 i P9. W oparciu o mutacje zidentyfikowane w klonach cDNA, zidentyfikowaliśmy dwa enzymy restrykcyjne, które mogą rozpoznawać mutacje. Jak wskazano na Figurze 2b, mutacja w pozycji P6 (T. C) spowodowała, że produkt P1A był podatny na trawienie przez Fnu4HI, podczas gdy mutacja w pozycji P9 (T. C) umożliwiła rozpoznanie przez AvaII. W związku z tym przeanalizowaliśmy genomowe produkty PCR z wielu klonów komórek macierzystych komórek J558-Neo, Tum i Tum 2 pod kątem obecności zmian genetycznych. Jak pokazano na Fig. 2b, żaden produkt PCR z żadnego z 37 klonów z komórek J558-Neo nie posiadał mutacji P6 i P9. Dalsza analiza sekwencji wielu klonów nie ujawniła żadnych mutacji w antygenowych epitopach macierzystych komórek nowotworowych J558-Neo, w tym tych, które zostały przepuszczone in vitro lub in vivo w nieleczonych RAG-2 (3 (3). myszy (dane nie pokazane). Tak więc, przy braku silnej odpowiedzi immunologicznej, antygenowy epitop P1A pozostaje niezmieniony. Klony izolowane z linii Tum można podzielić na cztery grupy (b, dolny panel). Grupa (3/35) zachowała mutację w P9. Grupa 2 (3/35) okazała się niejednorodna w pozycji P9, natomiast nie miała mutacji w P6. Nasza analiza transkryptów RNA pochodzących z reprezentatywnego klonu z tej grupy za pomocą RT-PCR ujawniła, że jedyną wyrażoną postacią był P1A (9L) (c). Zatem inny potencjalny allel został unieczynniony przez jakiś jeszcze niezidentyfikowany mechanizm. Grupa 3 (27/35), która reprezentowała większość klonów wyizolowanych z Tum 1, miała mutację w P6. Członkowie grupy 4 (2/35) są heterogeniczni w P6 mając sekwencję typu dzikiego w P9. Komórki w tej grupie zostały utracone przed analizą RNA, a zatem nie jest jasne, czy pozorny allel typu dzikiego był również inaktywowany. Klony Tum 2 można podzielić na dwie grupy, większość z nich (27/33) ma mutację w pozycji P6, a ich mniejszość (6/33) nie zawiera mutacji w żadnej z tych dwóch pozycji (Figura 2b, górny panel). Przeprowadziliśmy również szczegółową analizę sekwencji produktów PCR z Tum i Tum 2. Nasze sekwencjonowanie potwierdziło mutacje zidentyfikowane przez trawienie enzymatyczne. Ponadto, analiza klonów Tum 2, w których mutacje P1A nie zidentyfikowano przez trawienie enzymatyczne, ujawniła dodatkowe uszkodzenia w epitopie antygenowym. Spośród sześciu klonów z Tum 2 bez mutacji w P6 i P9, jeden miał mutację w P7 (T. C, co spowodowało substytucję L. P), podczas gdy pięć innych zawierało mutację w P8 (T. G, co prowadziło do. zastąpienie V. G), jak pokazano na Figurze 2a. Immunologiczne podstawy unikania guza w monoklonalnej terapii limfocytami T. Aby przetestować konsekwencje immunologiczne tych mutacji, peptydy P1A typu dzikiego i zmutowane zostały zsyntetyzowane i przetestowane pod kątem ich rozpoznania przez transgeniczne limfocyty T specyficzne wobec P1A. Peptyd wiążący H-2Ld z mysiego wirusa cytomegalii zastosowano jako kontrolę (Figura 3a). Jak pokazano na Figurze 3b, zmutowany peptyd P1A (9L) był 100-krotnie mniej silny niż typ dziki w indukowaniu proliferacji transgenicznych komórek T, podczas gdy zmutowany P1A (7P) był około 1000 razy mniej silny. Mutanty P1A (6R) i P1A (8G) nie indukowały żadnej wykrywalnej proliferacji komórek T. Figura 3 Mutacje w epitopie P1A zniosły lub drastycznie zredukowały rozpoznawanie antygenu w komórkach T. (a) Sekwencje AA peptydów zastosowanych w badaniu, ze zmienionym AA zaznaczonym pogrubieniem. (b) Proliferacja transgenicznych komórek T w odpowiedzi na peptyd P1A typu dzikiego lub zmutowany
[przypisy: szpital na szaserów warszawa, czy pasujemy do siebie test, ursus koszalin ]
[hasła pokrewne: ursus 8014, nafta kosmetyczna z olejkiem rycynowym, rehabilitacja po złamaniu szyjki kości udowej ]