Dryf antygenowy jako mechanizm unikania guza niszczenia przez limfocyty T cytolityczne ad

Po usunięciu niezwiązanych mAb, komórki inkubowano z perełkami magnetycznymi powleczonymi anty-Ig (BioSource International, Keystone, Colorado, USA). Komórki pokryte powłoką Ab zostały usunięte za pomocą magnesu. Niezwiązane komórki składały się z ponad 90% komórek T CD8, bez wykrywalnych komórek T CD4. Oczyszczone limfocyty T CD8 (5 x 106 / mysz) wstrzyknięto dożylnie myszom z dużymi guzami (> cm). W innych eksperymentach komórki śledziony 2 x 107 z TCR. myszy transgeniczne łańcucha (pokolenie F1 krzyżówki między transgenicznym założycielem i myszami BALB / c) lub ich nietransgeniczne mioty z mięty otrzymały adoptywnie myszy z guzami o średnicy powyżej cm. Wzrost guza określono na podstawie badania fizykalnego, podczas gdy liczbę komórek T reagujących na nowotwór monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej. Molekularna charakterystyka antygenu P1A z linii komórek nowotworowych opornych na dzikie i CTL. Ekspresję antygenu P1A nowotworu określono metodą RT-PCR, stosując wcześniej opisane warunki (13). Zastosowane startery to 5-GCCATGTCTGATAACAAGAAACCA-3. (forward) i 5. -TTGCAACTGCATGCCTAAGGTGAG-3. (rewers). Produkty PCR analizowano przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie klonowano i sekwencjonowano. W celu analizy zmiany genetycznej antygenu P1A wyizolowano genomowy DNA z komórek nowotworowych ex vivo lub ich subklonów, które otrzymano przez ograniczenie rozcieńczeń. Fragmenty genów P1A zamplifikowano za pomocą PCR stosując 5 (3-GCTAGCTTGCGACTCTACTCTTATCT-3. jako przedni primer i 5. -TCCACATCCCTTTCATACTGCTCC-3. jako podkład odwrotny. Produkty PCR klonowano i sekwencjonowano. W niektórych doświadczeniach produkty PCR analizowano przez trawienie panelem enzymów restrykcyjnych, a mianowicie AvaII, Fnu4HI, HaeIII i BbsI, które rozróżniają geny P1A typu dzikiego i zmutowane w pozycjach 1, 6, 7, 8 i 9. Synteza peptydów. Peptydy P1A typu dzikiego i zmutowane, a także kontrolny peptyd wiążący H-2Ld z mysiego wirusa cytomegalii. Wszystkie peptydy zostały zsyntetyzowane przez Research Genetics (Huntsville, Alabama, USA), rozpuszczone w etanolu i przechowywane w temperaturze ~ 20 ° C. Stabilizacja H-2Ld na powierzchni komórkowej na RMA-S-Ld. Komórki RMA-S (3d inkubowano z określonym stężeniem peptydów P1A typu dzikiego i zmutowanych w 37 ° C przez 16 godzin w obecności ludzkiej 2-mikroglobuliny (2,5 ug / ml; Sigma-Aldrich, St. , Missouri, USA). H-2Ld na powierzchni komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometrii przepływowej. Ekspresję H-2Ld na powierzchni komórki wykryto stosując biotynylowane mAb 28-14-8 (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA), a następnie znakowaną fikoerytryną streptawidynę znakowaną PE (PE). Aby określić wiązanie kompleksu H-2Ld: peptyd z transgenicznymi limfocytami T, użyliśmy dimeru H-2Ld: Ig (zakupionego z BD Pharmingen) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, 3 .g peptydów inkubowano z 4 .g kompleksu H-2Ld: Ig i P2-mikroglobulina w 4 ° C przez 48 godzin w całkowitej objętości 200 .l. Do roztworu dodano skoniugowane z PE szczurzą przeciwmysie mAb IgG1 na godzinę przed zastosowaniem go do wybarwienia komórek śledziony z myszy transgenicznych, których komórki T eksprymowały TCR swoisty dla kompleksu peptydu H-2Ld: P1A. Po przemyciu niezwiązanego kompleksu, komórki śledziony utrwalono 1% paraformaldehydem w PBS i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Test proliferacji. W celu pomiaru proliferacji transgenicznych komórek T, komórki T śledziony (105 / studzienkę) hodowano w 96-studzienkowych płytkach w obecności danych stężeń peptydów. Po 66 godzinach hodowli dodano 1,25 Ci / studzienkę 3H-tymidyny. Hodowle zebrano 12 godzin później i zmierzono wbudowanie 3H-TdR i zastosowano jako wskaźnik proliferacji komórek T. Test cytotoksyczności. Transgeniczne komórki śledziony stymulowano peptydem P1A (0,1 ug / ml) przez 4 dni i stosowano jako efektorory. Jako cele użyliśmy komórek P388D1 (H-2d) znakowanych 51Cr. Różne stężenia peptydów dodano do docelowych komórek bezpośrednio przed dodaniem efektorowych komórek T. W teście kompetycyjnym, dodane peptydy stanowiły mieszaninę o określonym stężeniu konkurujących peptydów i 10 ng / ml peptydu P1A typu dzikiego. Komórki efektorowe T i cele koinkubowano przez 6 godzin, a wartości procentowe lizy właściwej obliczono w oparciu o następujący wzór: specyficzna liza% = 100 x (cpp. Cpmmedium) / (cpmmax cpmmedium). Wyniki Monoklonalna transgeniczna terapia komórkami T dużych guzów in vivo selekcjonuje warianty nowotworowe oporne na komórki T. Ogólnie przyjmuje się, że duże guzy są wysoce oporne na terapię CTL. Aby przeanalizować mechanizm odpowiedzialny za taką oporność, przeszczepiliśmy plazmocytom J558-Neo do syngenicznej RAG-2. /. Myszy BALB / c
[przypisy: przetrząsarko zgrabiarka, ursus 8014, prawo wykonywania zawodu lekarza ]
[podobne: ursus 11054, ursus 8014h, przetrząsaczo zgrabiarka ]