Dryf antygenowy jako mechanizm unikania guza niszczenia przez limfocyty T cytolityczne ad 5

(c) Cytoliza komórek docelowych P388D1 pulsowanych danymi stężeniami peptydów wiążących H-2Ldy typu dzikiego, zmutowanych lub niespokrewnionych. E / T = 10. (d) Mutanty P1A nie wykazują aktywności antagonistycznej wobec P1CTL. Aktywowane komórki T specyficzne wobec P1A zastosowano jako efektorory. Docelowe komórki inkubowano wstępnie z mieszaniną P1A typu dzikiego (10 ng / ml) i wskazanymi stężeniami P1A lub peptydów kontrolnych zmutowanego lub dzikiego typu. E / T = 10. Przedstawione dane pochodzą z 6-godzinnego testu uwalniania 51Cr i są reprezentatywne dla trzech do pięciu niezależnych eksperymentów. Ctrl, kontrola. W teście CTL do pomiaru cytolizy docelowych komórek P388D1 (Figura 3c), peptyd P1A (9L) był co najmniej 10 do 100 razy mniej skuteczny niż peptyd typu dzikiego, podczas gdy P6 i P8 wykazywały 10 000-krotne zmniejszenie w wywoływanie cytolizy komórek docelowych. Najskuteczniejszą mutacją był P1A (8G), który całkowicie zlikwidował rozpoznawanie przez P1CTL. Ligandy TCR o niskiej awidności mogą być antagonistami TCR (18, 19). W celu sprawdzenia, czy zmutowane peptydy są antagonistami P1A, inkubowaliśmy różne stężenia peptydów P1A zmutowanych lub dzikich lub niespokrewnionych peptydów wiążących H-2Ld8, z komórkami docelowymi w obecności ustalonego stężenia peptydu P1A, i badali podatność komórek docelowych na CTL swoiste wobec P1A. Jak pokazano na Figurze 3d, P1A (9L) powodował zasadniczo brak hamowania cytolizy za pośrednictwem P1A. Umiarkowane hamowanie przez P1A (6R), P1A (7P) i P1A (8G) obserwowano tylko wtedy, gdy zmutowany peptyd był obecny w 1000 razy większym stężeniu niż peptyd P1A. Jednakże, ponieważ zmutowane peptydy były znacząco słabsze niż niespokrewniony peptyd, który nie wykazywał mierzalnej awidności wobec TCR (patrz poniżej), obserwowane hamowanie przez te zmutowane peptydy było prawdopodobnie spowodowane rywalizacją o wiązanie H-2Ld, a nie jego antagonizmem do TCR. Tak więc te zmutowane peptydy nie wykazywały żadnej antagonistycznej aktywności. Bez względu na to, które mutacje zachowywały się, wszystkie zmutowane klony J558-Neo były odporne na cytolizę przez aktywowane P1CTL (Figura 4). Tak więc, w warunkach fizjologicznych, w których peptydy antygenowe wytwarzano w dawkach granicznych, częściowa inaktywacja była wystarczająca do zapobiegania rozpoznawaniu komórek nowotworowych przez limfocyty T. Rycina 4 Wrażliwość subklonów typu dzikiego, Tum i Tum 2 na reaktywne wobec P1A CTL. Genotyp każdego klonu jest zaznaczony. Przedstawione dane są reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów. Teoretycznie zmniejszenie rozpoznawania peptydu antygenowego przez limfocyty T można przypisać albo zmniejszeniu wiązania peptydu do MHC, albo zmniejszeniu rozpoznawania kompleksu MHC: peptyd przez TCR. Określiliśmy wiązanie peptydów typu dzikiego i zmutowanych z H-2Ld, stosując klasyczny test stabilizacji H-2 z komórkami RMA-S transfekowanymi Ld (16). Wyniki podsumowano na Figurze 5. Co ciekawe, chociaż P6 nie było uważane za pozostałość kotwiczącą dla peptydu związanego z H-2Ldy, stwierdziliśmy, że P1A (6R) był nieco słabszy niż peptyd typu dzikiego w stabilizowaniu H-2Ld. Jest to prawdopodobnie spowodowane dodatnim ładunkiem wprowadzonym przez mutację. Podobnie, zastąpienie jednej dopuszczalnej pozostałości kotwiczącej (F) inną (L) w P9 miało również umiarkowany wpływ na wiązanie peptydu z H-2Ld. Zgodnie z oczekiwaniami, peptyd kontrolny z mysiego wirusa cytomegalii, który miał L w P9 również zmniejszył wiązanie z H-2Ld. Nieoczekiwanie mutacje w P7 i P8 zwiększyły wiązanie peptydu z H-2Ld. Wszystkie opisane zmiany były statystycznie istotne: P1A versus P1A (6R), P. 0,0001; P1A względem P1A (7P), P = 0,0492; P1A względem P1A (8G), P = 0,0316; P1A versus P1A (9L), P = 0,025. Figura 5 Peptyd wiąże się z H-2Ld. Po całonocnej inkubacji z (2-mikroglobuliną i z podanymi stężeniami peptydów, transfekowane komórki H-2Ldc RMA-S wybarwiono swoistym dla H-2Ldp mAb. (a) Reprezentatywne histogramy FACS. Liczby w panelach oznaczają średnią intensywność fluorescencji. (b) Ilościowe porównanie interakcji peptyd: H-2Ld. Przedstawione dane reprezentują od dwóch do czterech niezależnych eksperymentów. Istotność statystyczną określono za pomocą sparowanego testu t. Med, medium. Aby bezpośrednio zmierzyć wpływ tych mutacji na rozpoznawanie przez komórki T kompleksu H-2Ld: peptyd, załadowaliśmy H-2Ldrg z 166-krotnym nadmiarem peptydów i testowaliśmy ich wiązanie z P1CTL. Jak pokazano na Figurze 6a, w śledzionie myszy transgenicznych TCR około 94. 99% komórek T CD8 wykazywało wysoki poziom transgenicznych. łańcuch (brak Ab przeciwko V. jest dostępny). O tym samym odsetku komórek T CD8 wybarwiono dimerem H-2Ld: P1A. Przeciwnie, tylko około 0,1% komórek T CD8 barwiono kontrolnym dimerem peptydowym H-2Ld: peptyd. Wyniki te potwierdziły zarówno czułość, jak i swoistość testu wiązania dimeru
[patrz też: szczecin szpital wojskowy, przetrząsaczo zgrabiarka, ursus 8014 ]
[przypisy: szczecin szpital wojskowy, światowe centrum słuchu kajetany, pizza hawajska składniki ]