Czynnik uwalniający histaminę ma prozapalną rolę w mysich modelach astmy i alergii cd

GST-mHRF inkubowano z JK17 IgG w obecności lub nieobecności fragmentów Fab lub Fc przy różnych stosunkach molowych. Związane JK17 IgG wykryto sprzężonym z HRP przeciwciałem anty-. (C) lub skoniugowane z biotyną przeciwciało anty-IgG1, a następnie streptawidyna-HRP (D). (E i F) Współzawodnictwo przez Fab, ale nie Fc, fragmentów wiązania C38-2 IgE z HRF. GST-mHRF inkubowano z C38-2 IgE w obecności lub nieobecności fragmentów Fab lub Fc przy różnych stosunkach molowych. Związane IgE wykrywano sprzężoną z biotyną anty-mysim IgE, a następnie streptawidyną-HRP. * P <0,05. Wszystkie dane są reprezentatywne dla 2 eksperymentów. Peptydy odpowiadające miejscom wiążącym Ig w HRF hamują oddziaływania HRF-Ig. Następnie zmapowaliśmy miejsca wiązania Ig w HRF. Testy wiązania IgE i IgG przy użyciu panelu skróconych białek GST-mHRF dały podobne schematy wiązania (Figura 3, A i B oraz Suplementowa Figura 3). Główne miejsce wiązania Ig zmapowano na N-końcowym peptydzie z resztą 19 (N19), jako N19 znakowane GST (określane tutaj jako GST-N19), ale nie na białkach fuzyjnych GST zawierających krótsze fragmenty N-końcowe, związane Ig . Inne miejsce wiązania zostało odwzorowane na wewnętrzne reszty 79. 142 (Figura 3, A i B). Dalsze dokładne mapowanie zlokalizowało to ostatnie miejsce wiązania w regionie H3 (reszty 107. 135, nazywane GST-H3, Figura 3D i dane nie pokazane). Figura 3 Mapowanie miejsc wiązania IgE w HRF i hamowanie oddziaływań HRF-IgE przez peptydy N19 i H3 pochodzące z HRF. (A) Schemat pełnej długości (FL) i skrócone formy GST-mHRF stosowane do testów wiązania. Pokazano struktury domenowe, takie jak TCTP1PTCTP2 i H1AH3. (B) Mapowanie miejsca wiążącego IgE. Cząsteczki C38-2 (5 ug / ml) i OE (20 mg / ml) IgE inkubowano w studzienkach pokrytych GST-mHRF. Związane Igs wykrywano za pomocą testu ELISA. <0,1, wartość zbyt mała do wyświetlenia. (C) Hamowanie oddziaływań HRF-Ig przez N19. Cząsteczki IgE inkubowano w studzienkach opłaszczonych GST-mHRFa w obecności lub nieobecności wskazanych stężeń zawodników. Po inkubacji wykryto związane IgE za pomocą testu ELISA. (D) Hamowanie oddziaływań HRF-Ig przez GST-H3. * P <0,05, ** P <0,01. Dane są reprezentatywne dla eksperymentów 2 (B), 5 (C) lub 3 (D). Wewnątrzkomórkowy HRF może przyczyniać się do zapalenia alergicznego poprzez kontrolowanie progresji cyklu komórkowego, proliferację i przeżycie komórek odpornościowych i strukturalnych (8, 21, 32). Dlatego niezbędne jest znalezienie inhibitora oddziaływań HRF-Ig w celu zbadania zewnątrzkomórkowych funkcji HRF ., oddzielonych od wewnątrzkomórkowych funkcji HRF .. Przebadaliśmy, czy sekwencje HRF oddziałujące z Ig mogą służyć jako specyficzne inhibitory wiązania HRF z Ig. Rzeczywiście, GST-N19 hamował wiązanie IgE z mHRF z siłą podobną do pełnej długości GST-mHRF (Figura 3C). Jednak krótsze testowane peptydy mHRF (reszty a 6, A 12, A 16, 5 P 19 i 9 A 19) lub peptyd kodowany (KYI-N 16) nie hamowały wiązania HRF-IgE (Suplementowa Figura 4) . Eksperymenty kontrolne wykazały, że GST-N19 nie wpływa na właściwości wzrostu, które wchodzą pod kontrolę wewnątrzkomórkowych funkcji HRF (8): traktowanie różnych komórek 3.6 lub 36. M GST-N19 nie wpłynęło na ich żywotność lub proliferację (suplement 5). A (D), ani nie wpłynęło na apoptozę wywołaną przez wycofanie czynnika wzrostu w BMMC lub przez H2O2 w komórkach CHO-K1 (dodatkowa Figura 5, E i F). Te stężenia HRF były wyższe niż to wykazano uprzednio, dla stymulowania bazofilów (1,6 . 5. M, odnośnik 35). Co ważne, GST-N19 nie wszedł w BMMC (rysunek 4A). Syntetyczny peptyd N19 hamował także wiązanie IgE z mHRF i nie zmieniał wzrostu ani przeżycia różnych komórek (dodatkowa Figura 6). Podobnie jak GST-N19, GST-H3 również hamowało wiązanie IgE z mHRF (Figura 3D); GST-H3 nie wpłynęło ani na wzrost komórek ani na apoptozę, ani nie weszło do komórek (Suplementalna Figura 7 i dane nie pokazane). Wyniki te wskazują, że peptydy HRF N19 i H3 mogą być użyte do sondowania pozakomórkowych funkcji HRF in vitro i in vivo. Figura 4GST-N19 nie wchodzi do wnętrza komórki i służy jako inhibitor HRF. (A) BMMC inkubowano z białkiem TAT-GST, GST lub GST-N19 we wskazanych okresach czasu w 37 ° C. Przemyte komórki utrwalono, permeabilizowano i wybarwiono anty-GST, a następnie skoniugowaną z Alexa Fluor 488 (3 przeciw-mysim IgG. Jądra barwiono DAPI. Fluorescencję obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. DIC, różnicowy kontrast zakłóceń. Oryginalne powiększenie, × 150. Pokazano wartości procentowe komórek podobnych do reprezentatywnych obrazów (uzyskano .150 komórek). (B i C) BMMC inkubowano z 5 .g / ml wskazanego IgE i 100 .g / ml mHRF przez 45 minut (uwalnianie histaminy) lub 20 godzin (wytwarzanie IL-6). [patrz też: olej kokosowy organiczny, okulistyka ceglana katowice, tomografia komputerowa gdynia ] [hasła pokrewne: rehabilitacja po złamaniu szyjki kości udowej, szczecin szpital wojskowy, światowe centrum słuchu kajetany ]