Czynnik uwalniający histaminę ma prozapalną rolę w mysich modelach astmy i alergii ad

W tym badaniu staraliśmy się zidentyfikować cząsteczki oddziałujące z HRF i inhibitory interakcji HRF z cząsteczkami reagującymi z HRF. Wyniki HRF wiąże się z fragmentami Fab podzbioru przeciwciał IgE i IgG. Pomimo wcześniejszych badań sugerujących, że IgE nie wchodzi w interakcje z HRF (34), ponownie zbadaliśmy tę możliwość za pomocą testu ELISA i panelu mAb IgE. Jak pokazano na Figurze 1A, unieruchomione na końcu N glutationowe S-transferaza znakowane. Tagged (znakowane GST) mysie białko HRF (określane tutaj jako GST-mHRF) wiązało C38-2 i 5 innych mAb IgE. Przeciwnie, C48-2 i 12 innych mAb IgE nie wiązały GST-mHRF. Podobne wyniki uzyskano, gdy jako środek wychwytujący zastosowano znakowany C-terminalnie mHRF znakowany heksahistydyną (określany tutaj jako mHRF-His6) (dodatkowa postać 1, materiał dodatkowy dostępny online w tym artykule; doi: 10,1172 / JCI59072DS1). Interakcję mAb C38-2 i IGELa2 IgE z mHRF wykazano również przez pulle-rację powinowactwa (Figura 1B i dane nie przedstawione). HRF wiąże się z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy (BMMC) preinkubowanych z C38-2 IgE reaktywnymi względem HRF, ale nie z niereaktywnymi HRF C48-2 IgE, w eksperymentach z cytometrią przepływową (Figura 1C). Jednakże nie zaobserwowaliśmy wiązania HRF z inkubowanym przez C38-2 IgE p FcpRl / b. BMMC, które nie wykazują ekspresji Fc. RI o wysokim powinowactwie do receptora IgE. Stwierdziliśmy również, że 9 z 34 badanych mAb IgG wiąże się z mHRF (Figura 1D). Wiązanie HRF było niezależne od izotypu IgG lub swoistości antygenu. Na przykład, cząsteczki IgG wiążące HRF JK31 i JK96 oraz cząsteczka JK116 wiążąca inne niż HRF IgG rozpoznają ten sam antygen wirusowy. Rysunek Podzbiór cząsteczki IgE i IgG wiąże HRF. (A) Cząsteczki IgE inkubowano w studzienkach pokrytych GST-mHRFa. Związane z HRF IgE oznaczono ilościowo za pomocą testu ELISA, co wykryto przez wywoływanie barwy za pomocą HRP. Pokazano wartości OD450 z GST-mHRF odjęte od tych z kontrolą GST. OD450. 0,1 zostało użyte jako dowolna wartość odcięcia. Dane reprezentują co najmniej 3 eksperymenty. (B) IgE inkubowano z kuleczkami agarozowymi GST lub GST-mHRFa. Związane z kulkami IgE zostały rozebrane. Białka IgE i GST wykryto metodą immunoblottingu. Ścieżki były prowadzone na tym samym żelu, ale nie były spójne (białe linie). Reprezentant 2 eksperymentów. (C) BMMC preinkubowane (czarna linia) lub bez (szare cieniowanie) wskazane IgE (patrz Tabela dodatkowa 3) inkubowano z mHRF-His6, a związany mHRF-His6 wykrywano króliczym przeciwciałem anty-His i Alexa Fluor 647 sprzężone anty-królicze IgG. Wiązanie HRF wykryto za pomocą cytometrii przepływowej. Wypustki wykazują wiązanie IgE: te same komórki inkubowano ze znakowanym FITC anty-mysim IgE. Reprezentant 2 eksperymentów. (D) IgG związane z HRF wykrywano metodą ELISA. Reprezentant 3 eksperymentów. Wiązanie HRF było niezależne od izotypu IgG, ponieważ badane cząsteczki IgG1, IgG2a i IgG2b zawierały zarówno reaktywne jak i niereaktywne cząsteczki HRF. Wartości KD dla wiązania HRF wynosiły 0,685. M (JK17), 2,78. M (JK31) i 5,78. M (JK96). Czarne słupki, IgG1; białe paski, IgG2a; szare słupki, IgG2b. Co ważne, fragment Fab, ale nie Fc cząsteczki IgG wiążącej HRF związanej z mHRF (Figura 2, A i B) i oddziaływanie IgE-HRF (lub IgG-HRF) był hamowany przez Fab, ale nie Fc, fragment (Figura 2, C = F). Zgodnie z tym, oddziaływanie między IgE specyficznymi wobec OVA a IgE i mHRF było hamowane przez OVA (Suplementowa Figura 2A), a inhibitory TNP-specyficzne (specyficzne dla TNP) IGELa2 lub C38-2 IgE i mHRF były hamowane przez TNP -glicyna (dodatkowa postać 2, C i E). Jednak interakcje IGELa2-mHRF i C38-2a-mHRF nie były hamowane przez TNPa-kwas glutaminowy (dodatkowa postać 2, C i E), a interakcja C38-2a mHFF nie była hamowana przez TNP-lizynę, podczas gdy IGELa2 interakcja -mHRF była hamowana przez TNP-lizynę. Wyniki te sugerują, że miejsce wiązania mHRF w IgE częściowo pokrywa się z miejscami wiązania antygenu. Łącznie wyniki te sugerują, że znaczna część przeciwciał u immunizowanych myszy oddziałuje z HRF. Ponadto, jedna z 5 badanych ludzkich IgE (tj. HE-1) wiąże GST-mHRF (dane nie przedstawione). Figura 2-reaktywne IgG wiąże HRF poprzez ich region Fab. (A i B) Fab, ale nie Fc, fragmenty związane z HRF. GST-mHRF naniesiono na 96-studzienkową płytkę ELISA. Po zablokowaniu 10% FCS, płytkę inkubowano z całymi cząsteczkami (IgG) lub z fragmentami Fab lub Fc wskazanych IgG. Fab związany z HRF wykryto przez inkubację z kozim anty-mysim sprzężonym z HRP. przeciwciało łańcuchowe. Fc lub IgG związane z HRF wykrywano sprzężonym z HRP anty-IgG. (C i D) Współzawodnictwo przez Fab, ale nie Fc, fragmentów wiązania JK17 IgG z HRF
[więcej w: przetrząsarko zgrabiarka, prawo wykonywania zawodu lekarza, rozmowa kwalifikacyjna przykład ]
[podobne: ursus koszalin, ursus 8014, nafta kosmetyczna z olejkiem rycynowym ]